ELISPOT 技術的現在
1996年以來隨著抗體制備、PVDF膜材等技術改良，ELISPOT 分析技術已經逐漸達到科研人員的期待，它已是當世公認最靈敏抗原特定T細胞的體外檢測技術。藉由檢驗新鮮分離PBMC細胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術可提示T細胞免疫系統的兩個重要參數：抗原特定T細胞的clone族群大小；和免疫效應細胞的信號傳導路徑Th1/Th2。
多年來經過數十個研究團隊的致力研究，對于ELISPOT分析技術本身的幾個問題，也有了科學上的驗證。目前一般公認，ELISPOT技術允許科研人員在單細胞水平上識別抗原特定T細胞，主要針對經由CD4或者CD8細胞的免疫反應。在適當的實驗設計下，ELISPOT Cytokine 斑點的數量分析顯示斑點是由一個單細胞所生成，同時斑點形態學與Time Response分析則顯示斑點直徑大小直接反映該細胞族群的產能。也因為如此，ELISPOT是個免疫學上的標竿技術，它可以允許科研人員在幾乎自然生理條件下，觀察細胞實際分泌Cytokine的進程，進而可以得到藥理學信息，闡明免疫調節藥物如何影響T細胞分泌各類cytokine的速率。藥物抑制T細胞免疫一般可通過兩程截然不同的機轉；使能分泌Cytokine的Precursor T細胞族群變小，或減少每Precursor T細胞的cytokine產能，而ELISPOT技術能提供雙份信息。
ELISPOT分析技術的幾個特點已經讓它在抗原特定T細胞免疫學上獨占鰲頭。此技術是當世唯一準許百萬分之一1:1000,000的準確分析，如此強效的解析力使流式細胞技術也望其項背，以目前國內外常規的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技術的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對T細胞免疫學研究是必須的，因為抗原特定T細胞一般在機體周邊循環系統發生的頻率通常低于萬中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技術被證實適用于冰凍后復蘇的人類淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離樣品有相當的效價，沒有喪失功能。這一點對臨床試驗非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣，如果試驗牽涉全國多個臨床試驗機構，病人血樣可冰存并同時集中在「中央實驗室」一齊被測試。同理，一個血樣或標準對照品可被分裝小份，被送到不同檢驗中心進行測試，以交互比對，同時有利LISPOT Cytokine技術流程的規范化、標準化。
流式細胞intracellular cytokine技術之靈敏度僅是萬中取一
ELISPOT 斑點的判讀
像多數的Cell-based分析技術一樣，ELISPOT Cytokine技術也是相當耗時、耗勞力的工作。事實上到目前為止，以目視法判讀少量細胞族群的特性如激活T細胞之激素分泌，仍被視為是免疫學技術上的一大挑戰。ELISPOT結果的判讀常需要專聘、有經驗的技術員才可以；有時就算有專職技師判讀，使用傳統的顯微鏡計算斑點數仍不免會偶有主觀意見，而有所偏頗。
科學實證的本質，在于如何使實驗結果能盡可能客觀、精確、同時有高重現性，傳統的人工計算法顯然無法達到此一要求。這就是Elispot Reader酶聯斑點分析儀應運而生。分析ELISPOT實驗數據的過程中，Elispot Reader儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后儲存成TIF檔；這些影像可以進一步使用手動、或是自動方式計算斑點數目，如果使用Elispot Reader分析軟件，可以先設定條件，然后同時分析斑點的大小，以推估激素分泌的多寡。預料像Elispot Reader這一類自動圖像掃描分析儀器，將可克服傳統顯微鏡判讀方法耗費人力、及人為客觀性等缺點，徹底解除ELISPOT分析技術的瓶頸問題，進一步推廣該技術的新穎應用。
Elispot Reader可以提供不同的數據格式，包括未處理與處理過的膜表面影像、每個小孔中的斑點數目、每個小孔中的平均斑點數目、每個小孔中斑點大小的直方統計圖。
ELISPOT 未來展望
據筆者的觀察，ELISPOT 分析技術正在歐美各國發揮它的完整潛能，它讓免疫學家可以直接洞察活體內T細胞相關生理學或病理學，就像是心臟外科醫師手上的那張心電圖，經由這個技術科研人員可以在活體內直接進入一個器官系統，在那里視察、發掘，得到全新的智識。
從各國文獻可見ELISPOT技術已經達到標準化、規范化的要求，并被廣泛地應用在多項領域，包括監視癌癥病人接受免疫療程時的反應(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、腫瘤(Nagorsen, 2000)、或自體免疫病人體內的一個特定的免疫反應型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技術同時也在數個疫苗效價評估人體試驗中，被當成重要的終結指針。2003年1月，世界衛生組織通過與大陸北京性艾中心合作，將應用ELISPOT技術來監測HIV疫苗研究免疫應答反應技術，該計劃是首次利用ELISPOT技術對亞洲國家從事HIV疫苗研究和臨床試驗的有關研究。我們期待未來此一技術能在我國免疫學界得到廣泛地應用。
其它ELISPOT應用范圍
· 移植研究 – allograft rejection
· 疫苗開發 -亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響
· Th0/Th1/Th2細胞轉換分析
· 自體免疫研究 – 免疫調節及免疫治療研究
· 癌癥研究 -腫瘤反應T細胞作用
· 過敏機制探討 – IL-4誘導免疫球蛋白亞型轉換，其它參與過敏機制之細胞激素研究
· 傳染疾病研究 – Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, …等
· 抗原決定位定圖
· 體液免疫力研究 – B細胞免疫球蛋白及特定亞型反應的進展研究
ELISPOT 應用領域
自身免疫檢測
器官移植
疫苗和藥品的研發與檢測
T 細胞功能研究
腫瘤研究
傳染病的研究和檢測
病毒研究等。
目前使用ElispotReader的部分研究領域如下
單細胞解析度/體外抗原特異性 T 細胞頻率的準確測量
測量 1 類和 2 類免疫力
T 細胞的同源性細胞因子產物與旁細胞因子產物
功能性 T 細胞親和力的測量
細胞因子協同表達 / 雙色 ELISPOT
斑點尺寸分布
PBMC的體外測量的分析到分析的重可生產性
新鮮和低溫儲藏后的人類PBMC的比較
CD 8+ T 細胞和CD8+ T 細胞和 Granzyme B 的 ELISPOT 分析
除了人類 PBMC 、鼠淋巴結/脾臟細胞以外的細胞的 ELISPOT 分析
免疫與佐藥
腫瘤免疫
移植免疫