4．1．3 分離
（1）編號
取五支無菌水試管，分別用記號筆標明10-1、10-2……10-5。
（2）稀釋
在無氧無菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，用無菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品，加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其混合均勻，制成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中，制成10-2稀釋液。依此進行10倍系列稀釋，至10-6，制成不同樣品稀釋液。通常選10-4、10-5、10-6三個稀釋度進行滾管計數。
（3）滾管分離
1）滾管
將無氧無菌的瓊脂培養基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒溫的水浴中，待用，當培養基從瓶中取出時，要用N2在培養基內中充氣。再在試管中用N2充氣，趕走所有管內空氣，然后把培養基加入管內，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管內，及時拔出充氣針頭。用無菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個稀釋度各0
.1mL，分別注入待用的試管中，然后將其平放于盛有冰水的瓷盤中迅速滾動，帶菌的溶化瓊脂在試管內壁會即刻形成凝固層。
2）分離純化
生成的菌落需挑取出來，鏡檢其形態及純度。如尚未獲得純培養物，需再次稀釋滾管，并再次挑取菌落，直至獲得純培養物為止。待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀察確定，做好標記。然后將培養基試管固定于適當的支架上，打開試管膠塞，同時迅速將氣流適當、火焰滅過菌的氮氣長針頭插入管內。同時，另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過菌的通氣針頭。將準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養基內，找準待挑菌落，輕輕吸取，轉移至液體試管內，加塞。37℃培養，培養24h或更長時間或待培養液混濁后檢查已分離培養物的純度。
3）劃線分離
將試管橡皮塞的一端在火焰上灼燒一下，挨著打氣針塞住管口，在針頭快速取下前，通氣15-20s，管口一端在火焰上燒片刻。旋緊管塞，劃線后的卷管直立保溫，使用CO2:H2=80:20,因為CO2比空氣重，開啟后管塞不致有空氣殘留。劃線后的滾管，置34-37度下培養，便可長出菌落。
4．1．4 鏡檢與計數
（1）鏡檢
挑取特征性菌落制片，革蘭氏染色后鏡檢，觀察菌體形態。
（2）計數
液體純培養物經系列稀釋后，按上述滾管法培養。然后對固體滾管計數，計算每克或每毫升樣品中含有厭氧菌數量cfu/g（mL）樣品=A×10ml×X/10×D
A-0.1mL滾管計數的實際平均值；
X- 鏡檢呈現為厭氧菌的數目；
X/10-菌落中厭氧菌的概率；
D- 稀釋倍數
4．2 菌種的鑒定
4．2．1糖發酵試驗
糖發酵實驗是最常用的生化反應，在腸道細菌鑒定上尤為重要。絕大多數細菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是它們在分解糖的能力上有很大差異，有些細菌能分解糖并產酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫、甲烷、二氧化碳等）；有些細菌只產酸不產氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產酸并產氣；傷寒桿菌能分解葡萄糖產酸不產氣，不能分解乳糖；普通變形桿菌分解葡萄糖產酸產氣，不能分解乳糖。酸的產生可以利用指示劑來斷定。在配制培養基時預先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8（紫色）]，當發酵產酸時，可使培養基由紫色變為黃色。氣體的產生可由發酵管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。
具體實驗步驟：
① 將菌液進行適當稀釋，之后在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。
② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。
③ 24h后觀察各管中液體顏色變化及產氣情況。
4．2．2 蛋白質分解實驗
① 將菌液進行適當稀釋，之后在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。
② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。
③24h后各管分別進行米倫氏反應、吲哚反應、黃色反應和坂口反應等。
4．2．3 淀粉水解實驗
① 將菌液進行適當稀釋，之后在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。
② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。
③ 24h后于各管中加入適量盧戈氏碘液觀察淀粉的水解情況。
五 注意事項及注釋：
1 注射器在使用前必須經過121℃、20min滅菌。
2 注意無菌操作，保持手和培養管的清潔。每次接種前需用酒精棉球將厭氧管蓋子擦一遍。
3 用注射器吸取菌懸液注入固體培養基后，如需再次吸取，應快速將注射器插入厭氧管中，以防止針頭污染。
4樹脂刃天青（resazurin）既是還原劑又是指示劑，它可以把培養基中殘留的溶解氧去除，其氧化還原電位指示敏感范圍為-42mV。有氧時呈紫色或粉紅色，無氧時呈無色（培養基的顏色），它是較為理想的氧化還原電位指示劑和培養嚴格厭氧菌不可缺少的。
5培養基中加入的青霉素是用來抑制其它細菌生長的，因為厭氧菌的細胞壁成分為假肽聚糖，不受青霉素影響。
6注射器在使用前必須先用培養基上面的氣體沖洗、填充，然后插入培養基的下層，以保證當培養基移入試管時，就處于無氧氣體層的下面。