1.3信號的檢測
在洗去未雜交和錯配對的探針分子之后，載片培養在免疫熒光試劑中，使其在探針雜交的位置上產生熒光信號，偶聯了熒光素分子的抗生物素蛋白被用來標記已摻入到探針分子中的生物素。地谷新，二硝基苯，AFF和硫磺酸鹽則可以用相應地標上了熒光素地抗免疫球蛋白來標記。
最常用地熒光素分子有FITC，rrhodamine和Texas Red等。
1.4分帶和信號定位
染
色體地分帶可以在雜交前，也可以在雜交后。高分辨的染色體標本是取得最好的帶形的基礎。常用的分帶方法有G（giemsa）帶、
Q（quinacrine）帶、R（reverse）帶，包括色霉素chromomycin A3/偏端霉素distamycin
A法；hoechst33258/propidium
iodide[3，8-二氨基-5-[3-（二乙基-甲基氨）丙基]6－苯菲碘]法；DAPI[DAPI：4，6-diamidino-2-
phenylindole 2HCl]/propidium lodide法，染色體的分帶也可以直接用Alu LIHs(LI homo
sapiens)或Alu之間的順序和染色體雜交而得到類似R帶的條帶。更多的人在努力使雜交信號和分帶可以同時在顯微鏡下看到。
由于雜交和分帶同時進行效果不佳，有人采用FL（fractional length）來測量。以雜交信號相對于某固定位置（如端粒）的長度占該染色體長度的比例來表示。
在不分帶的情況下，特定的染色體可以通過著絲粒特異，或端粒特異的探針進行共雜交來確定。復雜的探針族，如從一個染色體特異的DNA文庫中得來克隆，可以用來修飾和確認染色體，稱為染色體繪圖。
影響雜交結果的參數有下列幾個：探針濃度，雜交時間，探針大小，雜交溫度，染色質變性條件染色體得制備和硬化程度，Rnase作用條件，用于降低背景的非特
異性競爭DNA和醋酸酐處理，具體地講是DNA探針的純度；用于雜交反應的探針的大小，小心掌握好這些條件，我們就能得到沒有熒光背景的特異信號。
FISH
的結果還有一個重要的方面，就是分辨率的問題。影響結果分辨率的因素有兩個，染色體上的特異位置和染色體的濃縮程度。著絲粒和端粒的變化比其他的染色體位
置的變化要多，在分析結果時就比較容易辨認。特定的染色體結構在其雜交結果的分辨率上起著重要的作用。制備染色體比較伸展狀態的展片，如早中期染色體或中
期染色體，將會得到較高的分辨率。另外，光學系統的進步也是提高分辨率的有效手段。
2.FISH技術的特點
FISH技術和同位素原位雜交相比，有著許多的優點。
首先，從探針的制備雜交來看，生物素和其他標記分子沒有放射性，標記過程和雜交過程沒有污染的危險，比較安全。且用生物素或其他的標記分子標記好以后的探針分子 相當穩定，沒有半衰期的限制，可以長期保存。熒光顯色時間短，不像同位素雜交要求長時間曝光。背景簡單，靈敏度也不遜色。另外，FISH可以用多種顏色同 時顯色。這是同位素雜交不可比擬的。這種多色作圖，可以使染色體分帶和探針信號不同的顏色而同時觀察；也可以用不同熒光標記不同的探針，以確定探針在染色 體上的相對位置。
間期核作圖也是FISH的一個特色，因為它常常核多色技術結合在一起。中期染色體的FISH的分辨率大約為1Mb，而間期核
作圖的精度為50kb。這一精度的變化使FISH有可能直接用于基因作圖。可以朔間期核作圖技術是遺傳研究和脈沖電泳結果的橋梁。與遺傳圖譜不同，它不依
靠多態性指標和大的家系；也不像脈沖電泳后的稀切點酶物理圖譜分析，它不依靠稀切點的存在和甲基化程度，并且不受CpG島出現頻率的影響。它的原理是間期
核上DNA順序間的距離與線性DNA分子上該兩個順序間的距離呈對應的線性關系。由于這些原因間期核作圖可以作為遺傳作圖核物理作圖分析的輔助結果構建染
色體亞區的基因圖。間期細胞原位雜交還可用于不能制備中期染色體的細胞的研究，如腫瘤細胞核非周期細胞。
信號擴增也是FISH所特有的。為了
使雜交信號足夠強，可以進行信號擴增。擴增的方法是加上一層熒光標記的標記分子的抗體，再加上一層偶聯了標記分子的抗體，然后再加上一層熒光標記的標記分
子的抗體，形成三明治結構。以生物素標記為例，在加熒光標記的抗體生物素蛋白avidin之后，加一層山羊生物素標記抗-抗生物素D，然后再加上一層熒光
標記的抗生物素蛋白。
用于人染色體作圖的典型探針是cDNA或克隆的基因組DNA片段，大多數cDNA由單拷貝順序組成，SCP由單拷貝的基因組順序組成。而大多數的克隆基
因片段中除了單拷貝順序外還有插入重復順序（interspersed repeatitive
sequence，IRS），如Alu，據分析每3－5kb就有一個Alu順序，所以在用cos質粒核YAC（yeast artificial
chromosone，酵母人工染色體）作為探針時，就會有一些重復順序干擾單一順序產生特異性信號。通常將標記好的探針片段變性，與過量的非標記的競爭
DNA一起復性，常用的有人總DNA或Cot1DNA。這是探針中的IRS就很快地與競爭DNA中地IRS結合，剩下的是已標記了單拷貝順序，所看到的染
色體上的雜交信號就表明了單拷貝順序所在的位置，這一過程在FISH中叫做抑制性雜交。抑制性雜交的使用使FISH的應用更加廣泛，并可能在人類基因組的研究中發揮其作用。