從Rostaing等[2]發表流式細胞術檢細胞內細胞因子的方法后，陸續有人研究了流式細胞術檢測細胞內因子方法的可行性及重復性等問題。雖然活化T淋巴細胞有各種各樣的方法，如：PMA、PHA、Con
A、CD3、CD2和CD28等。但是目前公認的較好的方法仍然是PMA和鈣離子載體的聯合刺激。研究發現在PMA的刺激后4h，IFN-γ和IL-4的表達就達到一個較高的水平，因而適合進行流式檢測。我們的研究結果發現，人的外周血T淋巴細胞表面的CD4表達受PMA的影響非常大，在刺激后2h即明顯下降，4h已經難于區分CD4陽性T淋巴細胞，因此這就難于確定Th細胞。雖然國內部分學者認為在PMA的刺激下，CD4仍可以維持一定的表達[3,4]，但是我們的結果和國內部分[5]及國外的大多數[2,6]研究結果表明，在PMA的刺激下，CD4表達迅速下調，此時采用CD4來標記Th細胞已經不能準確的檢測Th細胞，因而不能準確的反應Th1和Th2細胞的比率。而CD3和CD8的表達受PMA等刺激因子的影響很小，因此，目前，國外推薦的方法是采用CD3和CD8設門，區分CD4陽性T淋巴細胞。由于多色熒光標記流式檢測技術的發展，筆者認為采用4色標記技術檢測人Th細胞是目前最好的方法。這種方法可以實現一個檢測管，同時觀察Th1細胞和Th2細胞；可以檢測CD8＋細胞的細胞內因子的表達；還可以觀察IL-4和IFN-γ雙陽性細胞。一個檢測管同時染色，節約了抗體和勞動量等檢測成本。但是由于多色染色技術對流式的操作者有較高的要求，實施過程要注意補償調節等具體問題，我們曾經采用CYC標記的CD8和APC標記的CD3聯合設門區分Th細胞，由于CYC和APC在BD公司的流式細胞儀上，儀器的補償調節非常困難，最終放棄該方法，改用PerCP標記的CD8才解決這一問題。目前，國內一些流式細胞儀型號相對落后，不能進行4色染色標記技術，筆者認為可以采用雙管標記檢測法，即采用CD3、CD8和IFN-γ3色標記一管用于檢測Th1細胞；采用CD3、CD8和IL-4
3色標記一管用于檢測Th2細胞。采用這種方法的缺陷是每個樣品檢測管數增加，造成檢測成本增高，而且不能同時觀察IL－4和IFN-γ雙陽性細胞。國外有報道采用IFN-γ、IL-4和CD3進行3色標記[7]，這種方法只能觀察T淋巴細胞表達的細胞因子的變化，不能區分CD4＋和CD8＋細胞，筆者認為是一種不可取的方法。
我們在Balb/c小鼠實驗發現在PMA的刺激下，CD4表達雖然下調，但是其表達持續時間比人的持續時間明顯增長，在刺激8h后，仍然能維持一個較高的水平，因而能夠有效的區分Th細胞。因此，在Balb/c小鼠采用CD4和IFN-γ、IL-4進行3色標記技術就能有效的檢測Th細胞亞群。當然由于CD3和CD8的表達受PMA的影響很小，采用CD3、CD8和IFN-γ、IL-4進行4色標記技術也非常有效。另外，由于CD4不僅在T細胞上表達，還在單核細胞上表達，單獨用CD4設門容易受單核細胞的干擾，解決這個問題的一個辦法就是采用FSC和SSC散點圖來設門區分單核細胞和淋巴細胞，采用CD4直方圖區分CD4陰性和陽性細胞，最后采用既位于淋巴細胞區，有位于CD4＋區的細胞來定義為Th細胞，這樣可以有效的避免單核細胞的干擾。當然采用4色標記也是一種非常有效的避免單核細胞干擾的方法。
由于T淋巴細胞表達的因子非常多，檢測其它細胞因子可以參照檢測IL-4和IFN-γ的方法進行。凡是采用PMA等作為刺激劑的檢測方法均應考慮到PMA等刺激劑對于細胞表面抗原表達的影響，從而選擇最佳的熒光抗體標記，這是進行準確的檢測的基礎。
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