2. 菌株分子流行病學及疾病病因學研究:
傳統流行病學對于傳染病爆發中不同菌株的代謝分析、毒力分析、年代分析缺乏有效的手段。目前,大多數傳染病及地方病的病因已比較明確,但是,對于它們的分子機制卻了解很少。這主要是因為傳統的方法學的限制,無法用有限的人力、物力對大樣本量、多地區的信息在短時間內進行分析。由于方法上的欠缺,使防疫工作者很難從分子機制上探討導致傳染病爆發的菌株之間的異同,例如在歷史上幾次流行性感冒和霍亂的大流行,病原體有變異,但也有聯系,這對于這些疾病的今后防治有重要的指導意義。基因芯片與傳統的流行病學方法相結合,恰恰解決了這個矛盾。
Fitzgerald 等[ 24 ]用芯片技術對葡萄球菌的基因組的進化進行了分析,發現大約22
%的基因對葡萄球菌是可有可無的。同時這些基因的轉移在葡萄球菌的進化中起很重要的作用。對甲氧苯青霉素耐藥的葡萄球菌的mec 基因(一種抗
β2內酰胺的基因) 被水平的轉移了5 次,說明抗甲氧苯青霉素的菌株進化了多次,而不是從單一的原始菌株進化而來。這就可以解釋在20 世紀70
年代流行的中毒性休克綜合征 ( TSS)
是由宿主環境的改變造成,而不是由一個基因譜的快速變化產生的一個新的亞型。此研究說明基因芯片能夠對以往流行病學不能回答的問題(如造成TSS
流行的具體原因) 進行回答。芯片的出現是對傳統流行病學缺陷的有力補充。Lu 等[ 25
]在中國貴州等地對砷中毒性肝病的分子機制進行了研究。他們用cDNA 芯片對暴露在砷環境下6～10
年、已經有部分砷中毒癥狀的人群進行研究。通過研究他們認為基因表達譜的變化在砷中毒性肝病及肝癌中起決定性作用。該研究對于大規模流行病的病因調查又開辟了新的途徑。
3. 傳染病的診斷與鑒別診斷:傳染病在流行病學中占有非常重要的地位,尤其是近年來性傳播疾病(STD)
、結核病等的死灰復燃和大量新發現傳染病的出現,給各級防疫部門提出了嚴峻的考驗。在傳染病爆發中,傳統的流行病學研究從取樣、培養病原體到鑒別診斷,往往需要幾天時間,這對于傳染病的治療和控制極為不利。加之人員流動的頻繁和傳播機會的急劇增加,需要找到一種快速、方便方法進行診斷和鑒別診斷,而基因芯片恰恰能滿足以上要求。目前,在這方面已進行了初步的嘗試。Chizhikov
等[ 9 ]將部分沙門菌、志賀菌及埃希菌的毒力基因作為芯片上的探針,可以對以上三種菌進行檢測。另外,還出現了一些用于檢測HIV
及結核桿菌的芯片[ 10 ,11 ]
。但這還遠遠不夠。這些基因芯片的共同特點是檢測的探針少,所得到的信息少,只是對一種病原體或幾種相關的病原體的檢測,對于多種病原體的鑒別診斷仍未進行,應當說它們只是診斷芯片的雛形。但是,由于基因芯片對于疫情爆發后快速的初步診斷、傳染病的監控以及各地菌型變化的監測有得天獨厚的優勢,它以診斷快速、易攜帶及儲存方便而操作不需要太強的專業性等使基因芯片極易在地區及縣一級防疫部門推廣。目前,在這一領域還處于探索階段,但這是傳染病診斷中主要的發展方向之一。
三、存在的問題
盡管基因芯片技術已有許多方面的進步。但是在分子流行病學的具體應用中仍存在一些問題:首先,探針的雜交也有一定的錯配率,從而產生一定的背景,如何區分這種背景所造成的假陽性和由于傳染病樣品中由于拷貝數太低所造成的弱陽性,是傳染病診斷DNA
芯片面臨的主要挑戰,由于在傳染病診斷DNA
芯片中采用的密度較低,因此它的這些缺點就不如高密度芯片那樣嚴重。但是,由于其結果往往伴隨著許多重大疫情的處理,診斷必須十分慎重。
另一種對應用的限制來自芯片研究的成本。在芯片研究過程中,對樣品的標記及探針的制備都非常耗時、耗力。對病原微生物來說,由于絕大部分的病原微生物都是原核生物,它們的共同特點是沒有polyA
尾巴,因此無法象真核生物那樣通過polyA 尾巴純化mRNA ,并且用逆轉錄方法建立 cDNA 文庫。這就給制造芯片帶來很大的問題。Tao
等[ 26 ] 報道直接在混合的RNA 中(mRNA、tRNA、rRNA) 加入3’端的特異引物擴增cDNA
探針。但是,另一方面,與真核生物相比,病原微生物(原核生物或病毒) 的研究又有得天獨厚的優勢。因為這些微生物的基因組都較小,只有幾千個ORF ,
同時又沒有內含子,這樣就可以通過對每個ORF 進行擴增, 用擴增產物代替cDNA
,制備探針。這種探針的另外一個好處就是它包含了病原微生物所有的基因,這就避免了cDNA
文庫可能使某些基因遺漏的潛在問題。這樣雖然解決了建立cDNA 文庫的問題, 但是, 以大腸埃希菌為例, 4 290 個 ORF 就需要4
290個特殊的引物,這大大的增加了科研難度和成本。因此,如何方便、快捷的建立病原微生物的檢測探針是基因芯片研究中亟待突破的瓶頸。隨著新技術的不斷出現,基因芯片的成本將會越來越低。
第三,樣品的獲得與處理。對于傳染病診斷芯片來說,
樣品的來源廣泛并且混雜有各種各樣的干擾因素。在實際推廣過程中,要使廣大防疫部門在很短的時間內、在廣大農村地區很快的獲得象實驗室中獲得的樣品是不可能的。因此,這就需要傳染病診斷芯片有很高的特異性和敏感性。如何正確的對樣品進行簡單的處理,使混雜因素降到最低是廣大防疫工作者所面臨的主要挑戰。
第四,對于數據的處理和應用仍存在問題。基因芯片的出現對生物信息學提出了新的要求,對于大量的數據需要新的方法來處理。同時,對于基因芯片所提供的信息也要求更精確的判斷。Tao
等[ 26 ]對大腸埃希菌的全基因序列制成的芯片檢測細菌生長在微量葡萄糖環境和含葡萄糖的Luria
肉湯環境中基因組表達方式。他們發現絕大多數基因的翻譯表達明顯上升,而細菌在葡萄糖缺乏的環境中一些基因的表達也上升。這么多的基因表達發生了變化,這使數據的分析和應用變的很困難。更重要的是,許多基因同時變化可能使真正的原因被掩蓋,因為一個基因的變化往往導致一連串下游基因或調控基因全都發生變化,因此,如何找到真正引起這些連鎖反應的基因是科研人員需要注意的問題。另一個問題是,由于絕大多數病原微生物都是原核生物,它們的mRNA
多為多順反子,即一條mRNA 可翻譯成多種相關蛋白,所以它的cDNA
就代表了多個基因。而且編碼這些蛋白的基因相互交錯,即使以每個基因作為探針,在雜交時也很容易發生假陽性。這就對結果的判斷帶來很大的不便。這就需要其他相關領域的共同研究和幫助,如基因組草圖的繪制、二維蛋白電泳等。