3. 底物熒光素(Luciferin)是如何進入小鼠體內的？需要多少？
熒光素是腹腔注射或尾部靜脈注射進入小鼠體內的，約一分鐘就可以擴散到小鼠全身。 大部分發表的文章中，熒光素的濃度是150mg/kg
(見下圖)。20克的小鼠需要3毫克的熒光素，價錢約兩到三美元。常用方法是腹腔注射，擴散較慢，開始發光慢，持續發光長。若進行熒光素靜脈注射，擴散快，開始發光快，但發光持續時間很短。
4. 熒光素的體內代謝過程 不同品牌的熒光素底物的代謝過程不太一樣， 使用前最好做一些體外試驗，做一個標準曲線。下面是我們試驗的一些例子： 
5. 兩次觀察間隔時間最短為多長時間？ 觀察時間的間隔沒有最短限制， 只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動物體內有一定的代謝過程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道（見上圖），可以控制對下一次觀察結果的影響。
6. 熒光素酶基因，熒光素酶，熒光素底物有多大？可以透過血腦屏障嗎？ 熒光素酶有554個氨基酸，約50KD。熒光素酶的底物熒光素，約280道爾頓。熒光素的水溶性和脂溶性都非常好, 很容易穿透細胞膜和血腦屏障。
7. 做體內實驗的luciferin 與體外實驗的是不是一樣，如何購買？最小包裝多大？ 體內生物發光是用的是D-Luciferin，我們提供1g或小到100mg 的包裝。
8. 如何保證熒光素酶(Luciferase)的穩定性？ 熒光素酶基因是插到細胞染色體內的，當細胞分裂、轉移、分化時, 熒光酶也會得到持續穩定的表達。熒光素酶的半衰期約三個小時, 所以只有活細胞才能夠持續表達熒光素酶。
9.
標記的腫瘤接種以后，會發生luciferase的丟失嗎？
沒有正式的報道丟失Luciferase的情況。丟失的可能性及量非常小，不會影響實驗結果。一些實驗報道的結果中，標記的細胞在動物體內存活幾年的時間還可以持續發光，說明Luciferase基因的標記非常穩定。
10.
在in vitro 的細胞培養中，為什么要經常用抗生素篩選？
熒光素酶基因標記的細胞株是經過單克隆篩選培養過的穩定的細胞株。體外培養過程中，不篩選也可以，只要時間不是很長，
接種代數不要很多。到目前為止，還沒有發現基因丟失的情況。但若接種的代數過多，建議用藥物篩選一段時間或從原始的細胞株培養以保證細胞發光的強度。
11. 可以用腫瘤塊而不是細胞接種嗎？ 可以先用標記的細胞在皮下接種，然后從皮下取出腫瘤塊進行原位接種。
12. 熒光素酶基因在標記的細胞中有多少個COPY，在什么位點？ 細胞中的copy數目，和標記的位點對于實驗沒有任何影響，后來的實驗中基本不進行那樣的研究。
13. 標記細胞與標記基因所用的啟動子有何不同？ 標記細胞一般用在細胞內能穩定表達的啟動子, 顯示細胞的數目。標記基因一般用此基因的啟動子，與此基因平行表達, 顯示此基因的表達數目。
14.
熒光素酶的表達高低與所用啟動子的活性有關嗎？
有關，啟動子的活性高，則熒光素酶的表達高，啟動子的活性低，則熒光素酶的表達低。還可以根據此原理，用特定的啟動子驅動熒光素酶，來觀察該啟動子在活體動物體內的特定條件下的表達情況，并檢測影響該啟動子表達的因素。這正體現了應用活體成像技術研究的優勢。
15. 有幾種常用的熒光素酶？特性如何？ 常用的有兩種熒光素酶，Luciferase 和
Renilla熒光素酶，二者的底物不一樣，前者的底物是D-luciferin，后者的底物是coelentarizine
。二者的發光顏色不一樣，前者所發的光波長在540-600nm，后者所發的光波長在460-540nm左右。前者所發的光更容易透過組織，后者在體內的代謝比前者快。大部分的發表文章通常使用前者用作報告基因，
也有一些文章使用兩者進行雙標記。
16. 組織切片可以觀察到生物發光嗎？ 可以，但熒光酶的體外活性保持時間比較短， 約幾十分鐘。有相關的文獻。