醫科院張金蘭：基于UHPLCQTOFMS的酸性鞘糖脂代謝研究

　　本期推薦的是發表在 Journal of Analysis and Testing 2020年第3期的中國醫學科學院藥物研究所張金蘭研究員團隊原創論文“基于UHPLC-Q-TOF-MS的腦膠質瘤大鼠中酸性鞘糖脂代謝紊亂和替莫唑胺抗腦膠質作用的研究”。敬請閱讀。

　　酸性鞘糖脂（Acidic glycosphingolipids, AGSLs）是神經組織中高度豐富的鞘糖脂，分為神經節苷脂和硫苷脂兩大類。神經節苷脂由一分子神經酰胺和一分子含唾液酸的寡糖鏈組成，是目前發現的結構最復雜、種類最多的一類脂質化合物。根據神經節苷脂寡糖鏈中唾液酸數量的不同，可將神經節苷脂分為GM、GD、GT和GQ系列，分別表示寡糖鏈中含有一個到四個唾液酸分子；寡糖鏈中單糖數目的差異通過不同的數字表示，如GM系列包括GM1、GM2和GM3；唾液酸連接方式的不同，通過在數字后加上小寫英文字母加以區分，如GD1包括GD1a和GD1b。硫苷脂是由一分子的硫酸基團和一分子半乳糖基神經酰胺組成。腦組織的發育和中樞神經系統疾病等均被報道與AGSL密切相關。本研究基于實驗室已建立的酸性鞘糖脂分析方法，分析腦膠質瘤大鼠血漿和腦組織中不同AGSL化合物的變化，研究腦膠質瘤大鼠AGSL化合物代謝紊亂特點和替莫唑胺抗腫瘤的作用，深入地認識其藥效作用特點和機制。

　　采用大鼠右側紋狀體定位注射大鼠腦膠質瘤C6細胞，建立大鼠腦膠質瘤模型。手術后第11天，所有大鼠進行小動物核磁共振（MRI）評價，觀察腫瘤生長情況。選擇造模成功的10只大鼠隨機分為2組，每組5只，分別為模型組和替莫唑胺組。此外，另有5只注射空白細胞培養基的大鼠作為假手術組。從手術后第11天起，替莫唑胺組大鼠每日灌胃給予替莫唑胺給藥液（20 mg/kg），連續5天。手術后第18天，所有大鼠再次進行MRI評價，記錄腫瘤生長情況。第二次MRI評價后，進行大鼠血漿和腦組織樣品的取材。大鼠腦組織進行腫瘤組織、癌旁組織（距離腫瘤組織小于2 cm）和正常腦組織的分離。各組織在液氮中冷凍后，分別置于-80℃冰箱保存。

　　腦組織勻漿液或血漿前處理后進行UHPLC-Q-TOF-MS分析。儀器使用Agilent 1290 UPLC和6550 Q-TOF系統。色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse PlusC18 column (2.1×50 mm, 1.8 μm)。流動相A為含0.2%甲酸和10mM甲酸銨的水溶液，流動相B為含0.2%甲酸和10mM甲酸銨的甲醇溶液，以0.4 ml/min進行梯度洗脫。柱溫設置45 ℃，進樣體積為10 μl。質譜采用ESI源，正離子模式檢測。掃描范圍為600-2000 Da，MS/MS碰撞能量為20、40和60 eV。

　　使用Agilent MassHunter Q-TOF定量分析軟件進行色譜峰積分。采用內標法計算各個化合物的相對含量，d3-GM3 (d18:1/18:0) 和d3-sulfatide分別作為神經節苷脂和硫苷脂的內標。采用BCA法測定腦組織蛋白濃度，用于腦組織中AGSL化合物濃度校正。采用SPSS 軟件中的Shapiro-Wilk檢驗代謝物數據是否符合正態分布，對符合正態分布的變量采用T-檢驗，對不符合正態分布的變量采用Mann-Whitney U檢驗，尋找組間有顯著性差異的化合物，界定顯著性差異的臨界值為P<0.05。采用Simca.P軟件對所有數據進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)尋找潛在生物標志物。提取生物標志物的標準如下：(1)投影中的變量重要性值(VIP)大于1；(2)Jack-knife不確定區間不跨越0點；(3)S-plot中的Pcorr的絕對值大于0.58。

　　本研究基于實驗室已建立的酸性鞘糖脂分析方法，該方法能將具有不同寡糖鏈的神經節苷脂同分異構體在反相色譜柱上進行分離。使用該方法在大鼠腫瘤、癌旁和正常腦組織中分別定量143、142和142種AGSL化合物，其中141種AGSL化合物在各組織間一致。發現大鼠腦組織中多數AGSL化合物中的鞘氨醇主要以C18-和C20-形式存在。GD1a, GD1b, GM1和GT1b、GM3是腦組織含量最高的五類神經節苷脂（圖1），其含量總和占到腦組織神經節苷脂總量的88-89%，這與此前文獻報道的結果一致。

圖1 大鼠腦組織中AGSLs種類的分布。a正常大鼠腦組織中檢測到的AGSLs的TIC圖；b癌旁組織中AGSLs的TIC圖；c腫瘤組織中AGSLs的TIC圖；d正常大鼠腦組織中檢測到的AGSLs的EIC圖。e、癌旁組織中AGSLs的EIC圖；f腫瘤組織中AGSLs的EIC圖；g正常大鼠腦組織中AGSL種類的餅圖；h癌旁組織中AGSL種類的餅圖；i腫瘤組織中AGSL種類的餅圖。j 不同樣本間AGSL的維恩圖。

　　OPLS-DA分析顯示假手術組、模型組和替莫唑胺組有顯著區分（圖2）。

圖2 C6膠質瘤大鼠腫瘤、癌旁和正常腦組織中AGSL化合物OPLS-DA分析的得分圖。

　　潛在生物標志物主要存在于GD1a，GD1b，GM1， GM3和硫苷脂中（圖3）。

圖3 大鼠C6膠質瘤模型的潛在生物標志物 a大鼠腫瘤組織中的潛在生物標志物；b癌旁組織中的潛在生物標志物；c正常腦組織中的潛在生物標志物。*，Sham vs. Model；#，Model vs TMZ；單標：P＜0.05，雙標：P＜0.01

　　使用潛在生物標志物構建腦膠質瘤引起的酸性鞘糖脂代謝紊亂及替莫唑胺調節作用的相關代謝網絡，如圖4所示。GM1在維持神經元穩態和控制核內Ca2+方面起著重要作用。該作用通過調節細胞信號通路，如Na+/Ca2+交換器和ERK1/2磷酸化等影響神經功能。

圖4 TMZ對大鼠C6膠質瘤引起的AGSL紊亂的調控。

　　GM1可能誘導神經發生，促進細胞分化，對受損神經元起到神經保護和神經修復作用。此外，GM1制劑可幫助腦腫瘤動物改善神經元功能。給予TMZ后，大鼠癌旁組織中GM1(d18:0/16:0)和GM1(d18:1/17:0)的水平顯著上調，GM1的代謝產物GD1a(d18:0/16:0)在癌旁組織中也有明顯的上調，表明GM1可能參與C6膠質瘤引起的神經損傷修復。中樞神經系統的細胞增殖、粘附和分化受GM3調控。GM3可抑制EGF、PDGF和FGF受體的酪氨酸磷酸化，從而抑制細胞增殖。GM3還通過抑制EGF和FGF受體，降低膠質瘤細胞的運動性。此外，GM3還通過影響細胞粘附及其與ECM蛋白的相互作用，抑制癌細胞的入侵。用TMZ治療后，大鼠腫瘤組織中GM3（d18:1/22:0）/GM3（d20:1/20:0）的含量明顯增加，這可能是TMZ抑制C6膠質瘤的原因之一。硫苷脂參與各種生物過程，包括細胞粘附和生長、信號轉導、神經元可塑性和蛋白質販運。硫苷脂也是中樞和外周神經系統髓鞘的主要脂質成分其表達在許多腫瘤中高度上調，替莫唑胺可能通過降低硫苷脂的水平從而發揮抗腫瘤的作用。

　　本研究首次從AGLS調控的角度研究了TMZ的抗腫瘤作用。證實了腦膠質瘤導致AGSL紊亂的假說。此外，TMZ可能通過調節GM3、GM1、GD1a和硫化物的水平發揮抗膠質瘤的作用。

　　張金蘭研究員簡介

　　張金蘭 博士，研究員，博士研究生導師，北京協和醫學院藥物分析學系副系主任。

　　1992年于北京醫科大學（現北京大學醫學部）獲理學學士學位；1995年于中國協和醫科大學（現北京協和醫學院）獲理學碩士學位；2002年于中國協和醫科大學（現北京協和醫學院）獲藥物分析學博士學位。

　　1992年至今，一致從事藥物分析和藥物代謝的研究工作，1995年以來作為課題負責人承擔和完成了10余項國家和省部級研究課題，2009年度入選教育部新世紀優秀人才計劃。

　　主要研究方向包括：藥物分析新技術與方法研究；中草藥有效成分分析和代謝研究；代謝組學/脂質組學分析新技術研究和應用；新藥質量標準和代謝研究。

　　擔任《中國藥學》（英文版）、《藥物分析雜志》、《質譜學報》、Journal of Separation Science編委。中國質譜學會常務理事；全國生物計量技術委員會委員；中國分析測試協會青年學術委員會顧問；中華中醫藥學會中藥資源分會委員；中國醫藥生物技術協會藥物分析技術分會常務委員；中國實驗室合格評定委員會（CNAS）實驗室認可評審員；國際反興奮劑組織（WADA）實驗室認可評審員。