實驗步驟
一、材料
1. 胞質分裂阻滯微核試驗
2. 微核的著絲點檢測
(1)從硬皮病 C R E S T 亞型的患者中取得的血清樣本。
(2) F I T C 標記的兔抗人 I g G 二抗。
(3) 過氧化物酶標記的兔抗人 I g G 。
(4) 二胺基聯苯溶液（D A B ): I m g /m L 溶于 0. 5 mol/L Tris 堿緩沖溶液， p H 7. 6。
(5) NiCl2 溶 液 ： 8% 溶液溶于 0.5 mol/L Tris 堿緩沖溶液， p H 7. 6 , 使用前配制。
(6)D A B 反應混合物： I m L D A B 溶 液 ， 3 m L Tris 堿緩沖 溶 液 ， p H 7.6, 25NiCl2 溶液 ， 40 uL 0 ?I m o l / L 咪唑水溶液和 10 u L 30% 過氧化氫。使用前配制。
(7)中性紅溶液： 0.1 % 溶于雙蒸水。
二、方 法
1. 用于分離的人淋巴細胞的標準 CBMN 試驗
在這個實驗中只有出現在用 P H A 刺激后完成一次核分裂的細胞中的 M N i 才用于分析。這些細胞可通過由在第一次有絲分裂之前加入 Cyt B 使細胞不再進行后續細胞分裂而導致的雙核形態來辨認。在優化條件下 P H A 刺 激 后 72 h 在 所 有 活 細 胞 中（除去壞死和凋亡外的所有細胞）雙核細胞比例可達 3 5 % ?6 0 % 或更多。所有實驗設備都必須
達到生物安全要求以保護操作者，并且所有在此程序中使用的溶液需經過濾滅菌。
1.1 淋巴細胞的分離、細胞培養和細胞收集
（1）用含有抗凝劑肝素的管子收集新鮮靜脈血，置 于 22°C ， 4 h 內分離。
（2）用已滅菌的 0. 8 5 % NaCl 按 I : 1 稀釋血液，輕輕顛倒混勻。
（3）將稀釋后的血液輕輕覆蓋在 Ficoll Paque (Pharmacia) 密度梯度上，所用比例大 約 1 : 3 (例 如 2 mL Rcoll Paque 加 人 6 m L 稀釋的血液），小心不要擾動兩相界面。
(4)在 22°C 下 400 g■離心 25?40 min。
（5）淋巴細胞位于 Ficoll Paque 和稀釋的血漿之間。收集后在 22°C 加 人 3?5 倍體積的 HBSS。根 據 體 積 的 不 同 情 況 ，將 所 得 細 胞 懸 液 在 280? 400 g 下離心5?IOmin0
（6）棄上清，用 2 ?5 倍 體 積 HBSS 重 懸 細 胞 ，并 根 據 不 同 體 積 用 180?400 g 離心 5 min。
（7） 棄上清，用 I mL RPMI1640 培養液重懸細胞。
（8）細胞計數計算細胞濃度，根據臺盼藍實驗得到的活細胞比例調整細胞濃度。
（9） 用 含 有 1 0 % ?15% 滅 活 胎 牛 血 清 的 RPMI1640 培 養 液 調 整 細 胞 濃 度 至 0. 5 XIO6?I .OXlO6 細胞/mL, 并 在 圓 底 的 培 養 管 中（10 m m 寬）用 0.75?1.0 mL培養液進行培養。
（10）每個培養管中加入 10 ML/mL PHA (Glaxo Wellcome HA1 5 ) 刺激淋巴細胞分裂。將蓋擰松， 37°C ， 5 % C0 2, 濕潤條件下培養。 P H A 的濃度需根據產品的純度和來源進行優化，以 保 證 細 胞 在 用 Cyt B 阻滯后產生最大數量的雙核細胞。
（11） P H A 刺 激 44 h 后 ，每毫升培養液加人 4.5 pg CytB (戴手套和通風櫥內操作）：溶 解 IOOmL Cyt B 儲 液 ，加 入 900 培養液，混合。將 75 混 合 液 加 人 1m L ±普養液使終濃度為 4. 5 Mg Cyt B/mL (—些實驗室也成功地使用了 6. 0ugC y t B /m L 的濃度）。繼續培養。
（12）加入 C y t B 28 h 后用血細胞分離器（cytocentrifuge, ShandonElliot) 收集細胞。棄去 1 〇〇 uL 培養液，將細胞輕輕重懸于管中。將 100 ?120ul 細胞懸液轉移至血細胞離心杯（ShandonElliot) , 離心至每玻片產生兩個小點（見注釋1)。（如下設置細胞離心程序，時間： 5 min，轉速： I O O fiO 將玻片從血細胞分離器中移開，空氣干燥 1 〇 ?2 〇 m i n, 用 1 0 0 % 甲醇固定 l 0m in 。
（13）用不同的可區分細胞核與胞質界限的方法染色。在我們的實驗中使用的是「DiffQuik」，它是一種商業成品，能迅速、優化地給出結果（見注釋 1)。
（14） 染色后將玻片晾干并用 D P X 液蓋上蓋玻片。這一步驟需在通風櫥內完成，將片子放在通風櫥內儲存，直到需要使用。
對照和經遺傳毒物處理的細胞培養需有重復樣本 ，每個樣本都制備玻片。這對實驗數據標準差的獲取來說是必需的，例如變異系數（標準差），對于每組重復數據都需要標明（ 見注釋 2 和 3)。這一實驗設計見圖 2。
對于突光顯微鏡，推薦使用吖陡橙（40 ug/mL溶 于 Sorensen』 s 憐酸緩沖液， p H 6 . 9 ) 進行染色。如果沒有細胞離心機，可使用下面介紹的用于全血培養的方法準備玻片
1.2 玻 片 的 檢 查 以 及 M N 頻率的評價
最好用放大 1000 倍的光學顯微鏡或熒光顯微鏡觀 疲 誠 士 誠 屮 單 女 公 觀察玻片。玻 片 最 好 在 分 析 _代 號 標 記 ，這 樣 分 析人員不會知道玻片的含義（盲法）。分析數據需兩位不同的分析者用相同顯微鏡對每個重復實驗進 行 評 判（ 見注釋 4 和 5)。進行統計的細胞數（ 見注 釋 6 ) 需根據實驗預期檢測 M N 指數的變化值和預期的標準差確定。每張玻片需獲得
以下信息：
（1）計算至少 1000 個 雙 核（ B N ) 細 胞 內 的 微 核（M N i ) 數量以及 M N i 在 1000 個B N 細胞內的頻率。在 B N 細胞中計數 M N i 的標準如下。
（2）含有 0、 1 或更多微核（M N i ) 的 B N 細胞的分布；一個雙核細胞中的 M N i 數在正常人體淋巴細胞中約為0?3 個 ，但根據毒物暴露和年齡的不同有時可能大于3 個。
（3）在至少 1000 個 B N 細胞中出現微核的 B N 細胞頻率。
（4）統 計 1000 個 B N 細胞中細胞核質橋的頻率。在 B N 細胞中計數核質橋的標準如下。
（5） 每 500 個細胞中單核、雙核、三核和四核細胞的比例。從此信息可以得出核分裂 指 數（nuclear division index，稍后解釋）。
（6）在統計活的單核、雙核或多核細胞頻率的同時，統計在同張玻片上每 500 個細胞中由凋亡或壞死引起的已死或將死的細胞比例（ 評判標準稍后列出）（ 見注釋7)
需要注意的是當無法判斷如何對某一細胞進行分類時最好忽略該細胞。一張統計表中應包含的基本信息見表 1。
1.3 分 選 雙 核 細 胞 的 標 準 及 微 核 、細胞核質橋、核芽、凋亡和壞死的細胞的計數
（1）雙核細胞的分選標準：用 于 M N 頻率計算的胞質分裂阻滯的細胞須符合以下特征：
a. 細胞須為雙核。
b. 在一個雙核細胞的兩個細胞核須有完整的核膜，并須在一個細胞質內。
c. 雙核細胞中的兩個核的大小、染色形狀和密度應相似。
d. 在 B N 細胞中的兩個核可能由不超過 1/4 核直徑的細胞核質橋連接。
e. 在 B N 細胞中的兩個核可能相互接觸，但是不該重疊。只有在這兩個核的界限非常清晰時才能將此種重疊的雙核細胞計算在內。
f. 雙核細胞的胞質界限或細胞膜必須完整，并能與附近細胞清晰區分。
可以或不可以用于計數的雙核細胞的類型如圖 3 所示。 在計算微核細胞頻率時不應被包括的細胞種類包括單核、三核、四核和多核細胞，以及凋亡或壞死細胞（ 圖 4)。
微核計數的標準： M N i 在形態上和核相似，只是比核小。它們還有以下一些
特點：
a. 人淋巴細胞 M N i 直徑的大小通常占雙核細胞中主核直徑的 1/16?1/3, 其面積相當于主核的 1/256?1/9。
1.4 核 分 離 指 數 計 算（ N D I ) 以 及 核 分 離 細 胞 毒 性 指 數（ NDCI)
(1)根 據 Eastmond 和 Tucker 的 方 法（3 0 ) 計 算 N D I 。計 數 500 個活細胞，計算含有一個、兩個、三個或四個核的細胞頻率， N D I 計算公式如下：
N D I = ( M 1 + 2 X M 2 + 3 X M 3 + 4 X M 4)/N
M l ?M 4 指含有 1?4 個細胞核的細胞， N 表示總活細胞數。 N D I 指數以及雙核細胞的比例是比較淋巴細胞的有絲分裂反應以及測試藥物的細胞抑制作用的有效參數。
(2)用于評價核分裂狀態的更為準確的方法是將壞死和凋亡的細胞數包含在細胞總數內，因為在高劑量的毒性物質作用下死細胞可能占了很大的比例。所以需要注意的是如果不包括壞死和凋亡的細胞，雙核細胞比例和 N D I 指數會偏高。
(3) 下面經修正的公式可用于較為準確地估算核分裂狀態以及細胞分裂動力學的情況 ，這個公式考慮了壞死和凋亡的細胞。
NDCI= (A P + Nec+ M l+ 2X M2+ 3 X M3+ 4 X M4) /N*
NDCI: 核分裂細胞毒性指數（nuclear division cytotoxicity index); A p : 調亡的細胞； N e c : 壞死的細胞數； M l ?M 4 指含有 I?4 個細胞核的細胞； N *表示總 細 胞 數（ 活細胞和死細胞)。