實驗方法原理 提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞在含SDS(十二烷基硫酸鈉)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質,再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質,得到的DNA溶液經乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。
實驗材料 細菌
試劑、試劑盒 TE氯化銫溴化乙錠NaCl乙醇CTAB
儀器、耗材 離心機搖床
實驗步驟
1. 培養5 ml 的細菌培養物至飽和狀態,取1.5 ml 的培養物離心2 min。
2. 沉淀物加入567 μl 的TE緩沖液,用吸管反復吹打使之重懸。
3. 加入30 μl10%的SDS和3 ℃ 20 mg/ml蛋白酶K,混勻,于37℃溫育1 h。
4. 加入100 μl 5 mol/l NaCl充分混勻,再加入80 μlCTAB/NaCl溶液,混勻,于65℃溫育10 min。
5. 加入等體積的氯仿/異戊醇,混勻,離心4~5 min將上清液轉人一個新管中,如果難以移出上清,先用牙簽除去界面物質。
6. 加入等體積的酚/氯仿/異戊醇,混勻,離心5 min,將上清液轉入一只新管中。
7. 加入0.6體積異丙醇,輕輕混合直到DNA沉淀下來,用一個封口的巴斯德管將沉淀轉移至1 ml 的70%乙醇中洗滌。
8. 離心5 min,棄上清,用凍干機稍加干燥,重溶于的下100 μl TE緩沖液,每次酶切反應用10~15 μl。