實驗方法原理 用堿和SDS處理可以從大規模（500ml）的細菌培養物中分離質粒DNA，所獲得的質粒則可通過柱層析或CsCl-溴化乙錠梯度離心進一步純化
實驗步驟
材料：
緩沖液和溶液：
堿裂解液 I：
50 mmol/L 葡萄糖
25 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）
10 mmol/L EDTA（pH8.0）
（溶液 I 一次可配制 100 ml，在 15psi[1.05 kg/cm2] 壓力下蒸汽滅菌 15 min，保存于 4 攝氏度。）
堿裂解液 II：
0.2 N NaOH（從 10N 貯存液中現用稀釋）
1%（m/V）SDS
（溶液 II 要現用現配，室溫 下使用）
堿裂解液 III：
5mol/L 乙酸鉀 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
雙蒸水（去離子水）28.5 ml
所配成的溶液中鉀的濃度為 3mol/L，乙酸根的濃度為 5mol/L。保存于 4 攝氏度，用時置于冰浴中。）
另需：
乙醇
異丙醇
STE
TE（pH8.0）
溶菌酶（10 mg/ml）
現在開始實驗：
細胞的制備：
1. 挑取轉化 細菌的單菌落，接種到 30 ml 含適當抗生素的培養基中。
注：
a. 試管的體積應該至少比細菌培養物的體積大 4 倍。
b. 試管不宜蓋的太緊
c. 應在劇烈振搖下溫育
2. 在適當的溫度和搖速下培養菌液直至對數生長期晚期（OD600 約為 0.6）。
3. 在含 500 mlLB、YT 或 Terrific 培養液（預熱到 37 攝氏度）及適當抗生素的燒瓶（2L）中接種 25 ml 對數生長期晚期的菌液，將此培養液在 37 攝氏度劇烈振搖（300r/min）培養約 2.5 小時。
注：最后菌液的 OD600 值應為 0.4。由于不同菌株的生長速度不同，可稍微延長或縮短 培養時間，使最終的 OD 值為 0.4。
4. 若質粒為低或中拷貝數的松弛型質粒，在培養液中添加 2.5 ml 濃度為 34 mg/ml 的氯霉素，使其終濃度為 170 微克/ml。
注：對于高拷貝數的質粒不需要添加氯霉素。
5. 于 37 攝氏度，以 300r/min 劇烈振蕩再培養 12~16 h。
6. 取部分菌液（1~2 ml）到離心管中，4 攝氏度儲存。于 4 攝氏度，以 2700 g 離心 15 min 以收集余下的近 500 ml 培養物。棄上清，倒置離心管使殘余的上清流出。
7. 用 200 ml 冰預冷的 STE 重懸細菌沉淀，按步驟 6 所述重新收集細菌并貯存于零下 20 攝氏度。
8. 用步驟 6 中貯存的 1~2 ml 菌液提取質粒，采用酶切和瓊脂糖電泳分析此小量制備質粒，以確定大量培養菌液中正確的質粒已得到擴增。
注：設置這種對照可能看上去有點過于謹慎，然而它可以避免發生某些可能難以挽回、浪費大量時間的錯誤。
9、將步驟 7 中凍存的細菌在室溫下放置 5~10 min 使其解凍后， 用 18 ml（10 ml）堿裂解液 I 重懸。
注：只有步驟 4 中使用了氯霉素的菌液才應參照括號中的體積數。
10、加 2 ml（1 ml）新配置的 10 mg/ml 溶菌酶。
11、加 40 ml（20 ml）新配置的堿裂解液 II。蓋上離心管蓋，輕輕顛倒數次，徹底混勻，室溫下放置 5~10 min。
注：延長超螺旋 DNA 暴露于堿的時間會使其不可逆變性，所產生的環狀卷曲 DNA 不能被限制酶內切，而且它在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率為正常超螺旋 DNA 的兩倍，難以被溴化乙錠染色。從細菌中用堿裂解法提取質粒時可能 會看到微量的這種 DNA。
12. 加 20 ml（15 ml）冰預冷的堿裂解液 III。蓋上離心管蓋，輕輕地但完全地振蕩混勻幾次（此時應不再有分離的兩個液相）。 將離心管在冰上放置 10 min。
注：在放置過程中會出現由染色體 DNA、高分子量 RNA、鉀離子/SDS/蛋白質/細胞壁復合物一起形成的乳白色沉淀。在堿裂解液 III 中最好使用醋酸鉀而非醋酸鈉，因為十二烷基硫酸鉀鹽遠比鈉鹽難溶。
13. 在 4 攝氏度 20，000 g 離心堿裂解液 30 min，無須制動，讓轉頭自然停止。 將上清輕輕移入量筒中，棄去離心管中的沉淀。
注：不能形成緊密沉淀的原因常常是加入裂解液 II 時混勻不充分。如果細菌碎片不能形成緊密的沉淀，以 20,000 g 再次離心 15 min，然后將上清盡量移入干凈的離心管中。轉移的時候使用四層紗布過濾上清可以除去黏稠的基因組 DNA 和蛋白質沉淀殘余。
質粒 DNA 的回收：
14. 量取上清的體積，將其連同 0.6 倍體積的異丙醇一起移入一只潔凈離心管中并將其充分混勻，室溫下放置 10 min。
15. 在室溫下以 12,000 g 離心 15 min 回收核酸沉淀。
注：若在 4 攝氏度下離心會使鹽也沉淀下來。
16. 小心棄去上清，將離心管敞開蓋，倒置于紙巾上以除去殘余的上清。在室溫下用 70% 的宜春涮洗管底及管壁，倒掉乙醇，并用與真空管道相連的巴斯德吸管除去附于管壁的液滴。將離心管開口倒置于紙巾上使剩余的乙醇揮發掉。
注：如果用于干燥器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀，在某些情況下它會變得難以溶解并且可能變性。將沉淀在室溫下干燥 10~15 min 對于乙醇揮發來說是足夠了，而且不會引起 DNA 脫水。
17. 用 3 ml TE（pH8.0）溶解濕潤的核酸沉淀。
18. 粗制質粒 DNA 的純化可用柱層析法，聚乙二醇沉淀法或 CsCl-溴化乙錠梯度離心法。
19. 用限制酶酶切及凝膠電泳分析確證質粒的結構。