實驗材料 表達靶蛋白的大腸桿菌細胞
試劑、試劑盒 細胞裂解緩沖液 I細胞裂解緩沖液Ⅱ脫氧膽酸濃鹽酸包涵體溶解緩沖液 I包涵體溶解緩沖液ⅡKOHPMSFSDS 凝膠加樣緩沖液含尿素的 Tris-ClDNaseI溶菌酶SDS-聚丙烯酰胺凝膠
儀器、耗材 Sorvall GSA 轉頭或相當的轉頭pH 試紙磨光玻璃棒
實驗步驟
材料
緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的成分請參見附錄 1。
貯存液稀釋至適當濃度。
細胞裂解緩沖液 I
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
1mmol/LEDTA(pH8.0)
100 mmol/LNaCl
細胞裂解緩沖液Ⅱ, 冰冷
50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
10 mmol/L EDTA(pH8.0)
100 mmol/LNaCl
0.5% TritonX-100
脫氧膽酸
使用蛋白級的膽酸/去污劑。
HCl(12mol/L)(濃鹽酸）
包涵體溶解緩沖液 I
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
100 mmol/LNaCl
8mol/L 尿素
0.1mol/LPMSF
緩沖液現用現配。
包涵體溶解緩沖液Ⅱ
50 mmol/LKH2PO4(pH10.7)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
50 mmol/LNaCl
KOH(10mol/L)
PMSF(100 mmol/L)
1x 和 2XSDS 凝膠加樣緩沖液
不含 DTT 的 1x 和 2xSDS 凝膠加樣緩沖液室溫保存，lmol/LDTT 貯存液現用現加于上述緩沖液。
含尿素的 Tris-Cl(0.1mol/L,pH8.5)
僅限于方法 2 使用，請見步驟 7。配制內含尿素濃度遞增（如 0.5、1、2 和5mol/L) 的 0.1mol/L Tris-Cl(PH8.5)。使用前用固體尿素現用現配，不能使用任何尿素貯存液，因為尿素容易分解。
酶和緩沖液
DNaseI(1 mg/ml)
溶菌酶（10 mg/ml)
用 Tris-Cl(PH8.0) 現用現配。
凝膠
SDS-聚丙烯酰胺凝膠（10%)
用于分離蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠的制備請參考附錄 8。
離心機和轉頭
Sorvall GSA 轉頭或相當的轉頭
特別配備
pH 試紙
備用，請見步驟 10。
磨光玻璃棒
載體和細菌菌株
表達靶蛋白的大腸桿菌細胞
培養 1L 以包涵體形式表達靶蛋白的大腸桿菌細胞
方法
制備細胞抽提物
1.1L 表達細胞培養物于預先稱重的離心管中 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 轉頭）離心 15 min。
注意：步驟 2~4—定要在 4°C 進行。
2. 吸去上清，稱菌體沉淀的重量，每克（濕重）菌體加入 3 ml 細胞裂解緩沖液 I，輕輕旋動或用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。
3. 每克（濕重）菌體加入 4ul 100 mmol/LPMSF,80ul 10 mg/ml 溶菌酶，攪動 20 min 也可以加入其他蛋白酶抑制劑混和物（見方案 1)。
4. 每克（濕重）菌體加入 4 mg 脫氧膽酸，繼續攪動。
5. 懸液 37°C 放置，不時用磨光玻璃棒攪動，待其變黏時每克（濕重）菌體加入 20ul 1 mg/ml DNaseI。
6. 裂解液室溫放置，直至不再黏稠（約 30 min)。
純化和洗滌包涵體
7. 用下述兩種方法之一純化和洗滌包涵體。
方法 1: 用 Triton X-100 提取包涵體
下述流程是對 Marston 等（1984) 所用方法的改進。
a. 細胞裂解物 4°C 高速離心 15 min。
b. 傾倒去除上清，沉淀重懸于 9 倍體積的 4°C 細胞裂解緩沖液Ⅱ。
c. 懸液室溫放置 5 min。
d. 高速離心 15 min。
e. 傾倒上清，留置待用。沉淀重懸于 100ul 水。
f. 各取 10ul 上清和沉淀，分別與 10ul 2XSDS 凝膠加樣緩沖液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析靶蛋白的分布。
g. 必要時繼續步驟 8 溶解包涵體。
方法 2: 用尿素提取包涵體
下面的程序是用含有不同濃度尿素的緩沖液洗滌和溶解包涵體，摘自 Schoner 等 (1985)。
a. 細胞裂解物 4°C 高速離心 15 min。
注意：步驟 b、d 和 f 必須在 4°C 進行。
b. 傾倒去除上清，每克（濕重）菌體沉淀重懸于 1 ml 水中。每支 100ul 裝 4 支離心管，其余 4°C 保存。
c.4°C 高速離心 15 min。
d. 毎份沉淀重懸于 100ul 含不同濃度（如 0.5、1、2 和 5mol/L) 尿素的 0.1mol/L Tris-Cl(pH8.5)。
e.4°C 高速離心 15 min。
f. 傾倒上清，留置待用，每份菌體沉淀重懸于 100ul 水中。
g，各取 10ul 上清和沉淀，分別與 10ul 2XSDS 凝膠加樣緩沖液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析哪個濃度的尿素洗滌效果最佳。
h. 用步驟 g 確定的最佳濃度，按上述方案洗滌剩余包涵體沉淀（步驟 b)。
i. 必要時繼續步驟 8 溶解包涵體。
溶解包涵體
8. 取適量步驟 7 的重懸細胞沉淀，4°C 高速離心 15 min, 沉淀重懸于 100ul 含 0.1 mmol/LPMSF(現用現加）的包涵體溶解緩沖液 I。
9. 室溫放置 lh。
10. 把溶液加入到 9 倍體積的包涵體溶解緩沖液 II 中，室溫放置 30 min。檢査 pH 是否維持在 10.7, 必要時用 10mol/LKOH 調節。
11. 用 12mol/L 鹽酸將溶液 pH 調至 8.0, 室溫放置至少 30 min。
12. 室溫高速離心 15 min。
13. 傾倒上清，留置待用，沉淀重懸于 100ul 1XSDS 凝膠加樣緩沖液。
14. 取 10ul 上清與 10ul 2xSDS 凝膠加樣緩沖液混和，上清和沉淀分別進行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析溶解程度，繼續附加方案。