實驗材料 DNA
試劑、試劑盒 磷酸酶緩沖液封阻液牛血清蛋白TENBT
儀器、耗材 離心機分光光度計搖床
實驗步驟
1. 用DNA稀釋緩沖液，稀釋生物素酰化標準DNA，濃度為0、1、2、5、10和20 pg/μl。以同樣稀釋液處理待測DNA。
2. 對干硝酸纖維素濾膜：每個稀釋度取1 μl 點膜，在80℃供干約1 h接步驟4。
3. 對于足龍膜：每個稀釋度取1 μl 點膜，晾干后用紫外照射法將DNA交聯至膜上。接步驟4或化學發光檢測。
4. 用少量體枳AP7.5液沆膜1 min，在密封袋中（剪成合適大小），用10 ml 封阻液，37℃封閉1 h 注意排出氣泡。
5. 稀釋10 μl 親和素-AP交聯物至10 ml AP7.5。剪去封閉袋一角擠出封閉液，用親和素-AP交聯物代替，重新封口，在旋轉平臺室溫揺蕩10 min。
6. 從袋中取出濾膜移到一個淺盤中，用200 ml AP7.5冼2次，每次15 min。再用 200 ml AP9. 5洗1次，10 min，輕微搖蕩。
7. 加入33 μl 75mg/ml 的NBT至7.5 ml AP9.5液中，混勻。再加入25 μl 50 mg/ml BCIP，混勻。
8. 在淺盤中避光溫育溶液，不時觀察直至發色達到滿意程度為止。
9. 加TE pH8.0以終止反應，比較測定DNA樣品和標準DNA的顏色強度以確定生物素酰化dNTP的摻入效率。如果該探計至少有一半標準品的強度，它可作為探針用于原位雜交。
