試劑、試劑盒 ATEN 緩沖液聚乙烯乙二醇T5E5 緩沖液Dpn I蛋白酶 KRNA 酶 A5'端為生物素-TEG 且 3'端為核糖胞嘧啶的引物蛋白酶 K 處理過的 PCR 產物
儀器、耗材 磁鐵鏈霉抗生物素蛋白珠子
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
1X ATEN 緩沖液（見第 1 步）
10X ATEN 緩沖液（見方案 1 的配方）
聚乙烯乙二醇 (30%PEG,1.5mol/L 氯化鈉）
T5E5 緩沖液（見方案 1 的配方）
2. 酶和酶緩沖液
Dpn I
蛋白酶 K
RNA 酶 A
3. 核酸和寡核苷酸
5'端為生物素-TEG 且 3'端為核糖胞嘧啶的引物
蛋白酶 K 處理過的 PCR 產物
4. 專用設備
磁鐵
鏈霉抗生物素蛋白珠子（強烈推薦使用 Genoviskm 公司的產品）
二、方法
1. 用 5'端為生物素-TEG 且 3'端為核糖胞嘧啶的引物擴增目標片段。PCR 后，按方案 1 所述的操作進行 Dpn I、PEG 沉淀，在 T5E5 中進行 RNA 酶和蛋白酶 K 處理。加入 1/9 體積的 10XATEN 緩沖液使樣品最終含有 1XATEN 緩沖液。
2. 預沉淀珠子。在儲存試管中取出一些鏈霉抗生物素蛋白珠子，磁化它們，然后除去儲存緩沖液。用 10 倍體積的 1X ATEN 緩沖液淋洗珠子 2 次（其中的一次要在 80C 浸泡 5~lOmin)。用原始體積的 1XATEN 緩沖液重懸珠子，可以在 4°C 中最多放置 2 周。
淋洗的目的之一就是除去松散的鏈霉抗生物素蛋白。殘留的蛋白酶 K 不會破壞鏈霉抗生物素蛋白珠子。
3. 對于每一個 130ul 的蛋白酶 K 處理過的 PCR 產物，加入 15ul 的 10XATEN 緩沖液，然后 52°C 溫浴 30 min。有時，前面的 RNA 酶步驟或者是 65°C 蛋白酶 K 步驟會使一些引物熔化掉。髙鹽溫浴可以保證讓酶切好的引物暫時回到它們原來所處的黏性末端的相應位置上，以便讓 5'端的生物素把它們掛到珠子上。如果沒有這個重新退火的過程，一半的產物有時不能粘在一起。加入60~100ul 在步驟 2 中所準備好的重懸于 1XATEN 緩沖液的鏈霉抗生物素蛋白珠子，25°C 溫浴 30 min, 磁化它們。保留珠子的上清液，取一些電泳檢測珠子吸收的效率。
4. 用 200~500ul 的 1XATEN 緩沖液快速淋洗珠子 1~2 次，以除去更多的最初 PCR 模板和 RNA 酶。
5. 用 100ul 的 1XATEN 緩沖液在 80°C 加熱洗脫珠子 2~3 次，每次 3~5 min。把試管移到 80°C 含有磁鐵的熱模塊孔中幾分鐘。
6. 一次一個人用手握著溫熱的試管靠近一個磁鐵，或者放在磁鐵架上，然后趁熱吸取上清液。這就是含有 3'黏性末端的核糖克隆的 DNA。磁化這個含有 DNA 的上清液，或者離心，最后一次除去痕量的珠子，然后把它轉移到一個新管中。冰凍保存最多 2 周。
7. 這個 DNA 可以用來克隆。DNA 現在溶解于 1XATEN 緩沖液，保證在退火過程中 ATEN 的最終水平是 1X。按方案 1 所述的第 5 步開始克隆。