實驗方法原理 剪接體 ( spliccosome ) 是真核生物中從初級轉錄物中切除內含子的催化單位。剪接體包含 U1、U2、U4/U6、U5 snRNP 等 4 種小核糖核蛋白顆粒（snRNP ) 和大量的非 snRNP 蛋白。
實驗材料 HeLa 細胞
試劑、試劑盒 PBS-Earle緩沖液磷酸鹽緩沖液
儀器、耗材 Dounce 勻漿器S 型研杵免疫親和層析柱陰離子交換柱
實驗步驟
―、材料與設備
1. HeLa 細胞核提取物的制備
(1) 懸浮培養的 HeLa 細胞。
(2) PBS-Earle：130 mmol/L NaCl，20 mmol/L K2HPO4 / KH2PO4 ( pH 7.4）。
(3) 緩沖液 A：10 mmol/L HEPES-KOH（pH 8.0），10 mmoI/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L 1，4 二硫赤蘚醇 ( DTE )。
(4) 緩沖液 C：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )， 420 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L DTE，0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF），0.2 mmol/L EDTA（pH 8.0），25% ( V/V) 甘油。
(5) 緩沖液 G：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，150 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L DTE，0.5 mol/L PMSF，5% ( V/V）甘油。
(6) 40 ml Dounce 勻漿器和松緊合適的 S 型研杵。
2. 甘油梯度離心
(1) 緩沖液 C：20 mmol/L HEFES-KOH ( pH 8.0 )，420 mmol/L NaCl，1.5 mmoL/L MgCl2，0.5 mmol/L DTE，0.5 mmol/L PMSF，0.2 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
(2) 緩沖液 G：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，150 mmol KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L DTE，0.5 mmol/L PMSF，5%（V/V）甘油。
3. 采用抗 m3G 免疫親和層析純化 U 系列 snRNP
(1) 抗 m3G 免疫親和層析柱：把約 7 mg 抗 m3G 的 IgG（Euro-Diagnostica，Arnhem，The NetherUmds ) 按照 Pharmacia 公司提供的標準方法結合到 1 ml 經 CNBr 激活的 Stpharose 凝膠上。
(2) 緩沖液 C：20 mmol/L HEPES-KOH（pH 8.0），420 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L DTE，0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF)，0.2 mmol/L EDTA ( pH 8.0 )，25% （V/V）甘油。
(3) 緩沖液 C( 低）：除了用 5% 甘油外，其余成分同緩沖液 C。
(4) 緩沖液除了 NaCl 濃度為 250 mmol/L 外，其余成分同緩沖液 C（低）。
4. 用 Mono Q 層析法純化 U1 snRNP
(1) 緩沖液 Q-0：20 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.0)，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L DTE 和 0.5 mmol/L PMSF。
(2) 緩沖液 Q-50：緩沖液 Q-0 中加 50 mmol/L KCl。
(3) 緩沖液 Q-1000：緩沖液 Q-0 中加 1000 mmol/L KCl。
(4) 1 ml Mono Q 陰離子交換柱（Pharmacia）。
5. [ U4/U6、U5 ] 三聚 snRNP 復合物的純化
(1) H386 單克隆 IgG 抗體的免疫親和柱（Euro-Diagnostica，Arnhem，The Netherlands）。
(2) H386 抗體表位，序列為 DRDRERRRSHRSERERRRDRDKDRURDREHKR 的 32 肽，可按標準方法合成。
(3) 緩沖液 G：20 mmol/L HEPES KOH ( pH 8.0 )，150 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCI2，0.5 mmol/L DTE，0.5 mmol/L PMSF，3% ( V/V ) 甘油。
(4) 磷酸鹽緩沖液：10 mmol/L 磷酸鈉（pH 7.2 )。
6. 17S U2 snRNP 的純化
(1) 抗 m3G 免疫親和層析柱：同前。
(2) 緩沖液 G：同前。
二、操作方法
1. HeLa 細胞核提取物的制備
(1) 在 D MEM 培養基中 37℃ 懸浮培養 HeLa S3 細胞，培養基中加有 5% 新生小牛血清、50 μg/ml 青霉素，100 μg/ml 鏈霉素，對數生長期時細胞密度保持在 2.5X105~5X105/ml。為了獲得足夠的 U snRNP，細胞數應該達到 5X109（相當于培養 8~10 L 細胞）。
(2) 在 4℃ 1000 g 離心 10 min 收集細胞。
(3) 每 109 個細胞用 20 ml PBS-Earle 重懸，然后采用 1000 g 離心 10 min 收集細胞。
(4) 估計細胞沉淀的體積，用 5 倍體積的緩沖液 A 重懸。
(5) 讓細胞膨脹 10 min，再按步驟 (3) 的方法離心，然后用 2 倍體積的緩沖液 A 重懸。
(6) 用 Dounce 勻漿器勻漿 10 次破碎細胞。
(7) 用 SorvalI SA1：轉子連續離心兩次去除細胞質；1000 g 10 min 然后 25000 g 20 min。
(8) 用緩沖液 C 重懸沉淀，每 105 個細胞用 3 ml 緩沖液 C。
(9) 用 Dounce 勻漿器勻漿 10 次破碎細胞核。
(10) 把剩下的懸浮物轉移到燒杯里，用磁力攪拌器在冰上輕輕攪拌 30 min。
(11) 25000 g 離心 30 min 去除核膜。
(12) 剩下的上清就是在高鹽（420 mmol/L) 條件下得到的胞核提取物。提取物在液氮中速凍后可在 -80℃ 保存。
為得到有剪接活性的胞核提取物，可用 100 倍體積的緩沖液 G 透析 4~5 h，使其鹽濃度為 150 mmol/L，用這種方法制備的細胞核提取物在占到最終反應體積的 40%~60% 時是具有剪接活性的。5X109 個細胞可得到約 18 ml 的低鹽細胞核提取物。
2. 甘油梯度離心
根據 snRNP 的大小不同，可以用甘油密度梯度離心來分離不同種類的 snRNP。用密度梯度離心初步分級分離胞核提取物吋以顯著提高獲得的 snRNP 的純度。在采用密度梯度離心初步分離 17S U2 snRNP 和 25S [ U4/U6、U5 ] 聚 snRNP 時應該采用較低 的鹽濃度。
(1) 在無菌的 SW 28 管中用緩沖液 C ( 高鹽梯度）或緩沖液 G ( 低鹽梯度）于室溫制備 10%~30% 的線性甘油密度梯度。
(2) 在 4°C 靜置至少 1 h（最好過夜），使每個密度梯度內部達到平衡。
(3) 用移液器小心地將胞核提取物加至密度梯度上，30 ml 的 SW 28 密度梯度柱能上 8 ml 的提取物。
(4) 用低加速度于 2700 r/min（105 g）離心 17 h。終止離心時不要用制動。
(5) 用自動分級分離裝置收集各梯度，也可以用 Eppendorf 移液器每 1.5 ml —份從頂到底手工收集。
(6) 取每一部分的 1/10，酚：氯仿抽提后再用乙醇/乙酸鈉沉淀獲得 RNA。采用凝膠電泳并通過標準的銀染分析各部分的 U 系列snRNP。
3. 用抗 m3G 免疫親和層析純化 U 系列 snRNP
(1) 用 5 倍體積的緩沖液 C 洗柱，平衡抗 m3G 的免疫親和柱。至少應有 5 ml 的柱體積才能有效地結合 15 ml 的胞核提取物中的 U snRNP。
(2) 以 1.5 ml/h 的速度將高鹽條件下得到的胞核提取物過親和層析柱。
(3) 用 6 倍柱體積的緩沖液 C ( 低）洗脫非特異性結合的成分。
(4) 用 2 倍柱體積的 15 mmol/L 核苷洗脫特異結合的 U snRNP。m3G 可以溶解在高鹽緩沖液 [ 緩沖液 C ( 低）] 或中等濃度的鹽溶液（緩沖液 F )。如果采用緩沖液 F， U4、U5、U6 snRNP 將會以 [ U4/U6、U5 ] 聚 snRNP 復合物的形式被洗脫下來、15 ml 的胞核提取物中可以分離到約 4 mg 的 U snRNP。snRNP 在液氮中速凍后，可在 -80℃ 保存。
(5) 用 1 倍柱體積的 6 mol/L 尿素 [ 溶在緩沖液 C( 低）中 ] 洗柱，可以洗掉抗體結合的 m3G。
(6) 用 20 倍柱體積的緩沖液 C ( 低）冼柱可以再生親和層析柱，若要長期保存則應加入終濃度為 0.02% ( V/V ) 的 NaN4。
4. 用 Mono Q 層析法純化 U1 snRNP
(1) 用 20 倍體積的緩沖液 Q-1000 清洗層析系統。
(2) 用與步驟 ① 同樣體積的緩沖液 Q-50 洗柱并平衡。測定 280 nm 光吸收值并以此值作為零點。
(3) 用緩沖液 Q-0 稀釋通過抗 m3G 免疫親和層析獲得的 U snRNP，使一價離子的濃度低于 200 mmol/L。
(4) 把 U snRNP ( 1~40 mg ) 上到 Mono Q 柱中，流速為 2 ml/min。壓力不應超過 3.0 MPa。
(5) 用緩沖液 Q-50 洗柱，直至光吸收值為零 ( 通常需兩倍柱體積）。
(6) 以 1 ml/min 的流速洗脫 snRNP，通過編程 FPLC 控制器來控制 KCl 的濃度梯度。開始 KCI 濃度為 50 mmol/L ( 緩沖液 Q 50 )，然后在 4 min 內每分鐘增加緩沖液 Q-1000 5.4%，接著 30 min 內每分鐘增加 1%，然后 10 min 內每分鐘增加 4.2%。最后用 緩沖液 Q-1000 洗 4 min。洗脫過程中，按 1 ml 每份收集。U1 snRNP 的洗脫在 KCl 濃度為 350~370 mmol/L 時達到第一個高峰。
(7) 通過測 280 nm 光吸收值的方法來確定每份收集液中 U1 snRNP 的濃度（I A280 單位相當于 0.35 mg/ml），用 PAGE 的方法分析 RNA 和蛋白質成分。
(8) 12S U1 snRNP 中污染的 20S U5 snRNP 可進一步通過甘油密度梯度離心分離。
5. [ U4/U6、U5 ] 二聚 snRNP 復合物的純化
可以用兩種方法來分離 [ U4/U6、U5 ] 三聚 snRNP 復合物。第一種方法是用甘油梯度離心分離由帽特異抗體免疫親和層析得到的總 snRNP，這種方法操作較快，產出較高， 但三聚 snRNP 的純度較低。第二種方法則是用 H386 抗體進行免疫親和純化，這種抗體是采用 U1 snRNP 特異 70 kDa 蛋白制備的，但它對 [ U4/U6、U5 ] 三聚 snRNP 復合物中的一個 100 kDa 蛋白也有強烈的交叉反應。這種方法得到的 [ U4/U6、U5 ] 三聚 snRNP 相對較純，但較第一種方法麻煩，產出率也低。下面將簡單介紹第二種操作方法。
(1) 合并由甘油密度梯度離心分離到的 25S 的細胞核提取物，并以 1 ml/min 的流速通過 H386 免疫親和層析柱。2 ml 柱體積的親和柱最多可上 7 ml 細胞核提取物，相當于 4 份收集物，約含 100~150 μg U snRNP。
(2) 以 20 倍柱體積的緩沖液 G 洗掉非特異結合的成分。
(3) 用 5 倍柱體積的含 0.01 mmol/L 相對于 H386 主要抗原表位的競爭性 32 肽的緩沖液 G 洗脫特異結合的 U snRNP。每份收集 400 μl，取其中 1/10 用標準方法分析 RNA 和 蛋白組分。
(4) 如果有必要，可用前面介紹的甘油梯度離心法分離與 25S [ U4/U6、U5 ] 三聚 snRNP 共洗脫的微量 12S U1 snRNP。
(5) 先用 5 倍柱體積的磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L 磷酸鈉，pH 7.2 ) 洗脫，再用同樣體積含 3.5 mol/L MgCl2 的相同緩沖液洗脫，以洗脫與抗體結合的多肽。
(6) 用 10 倍柱體積的緩沖液 G 洗滌，使親和柱再生。若要長期保存則應加入終濃度為 0.02% ( V/V ) 的 NaN3。
6. 17S U2 snRNP 的純化
要得到含完整蛋白組分的 17S U2 snRNP 非常困難，這是因為當鹽濃度超過 200 mmol/L 時 U2 特異蛋白大多從 U2 snRNP 上分離，而且在 17S 的 U2 snRNP 中抗體也很難與 U2 RNA 的 m3G 帽結合，因此在用帽特異結合抗體免疫親和分離 17S U2 snRNP 之前，所有的實驗操作都要在低離子強度下進行，而在純化前應該去除大部分有良好外露帽結構的 snRNP。當從胞核提取物中分離時，應該先用甘油梯度離心獲得 17S U2 snRNP 的預分離物。
(1) 合并由甘油密度梯度離心得到的組分。用 H386 免疫親和層析柱去除少量的 12S U1 snRNP、U5 snRNP 和 [ U4/U6、U5 ] 三聚 snRNP。
(2) 把含 17S U2 snRNP 的流出液上到抗 m3G 的免疫親和層析柱中。
(3) 用 20 倍柱體積的緩沖液 G 洗脫非特異結合的物質。
(4) 按程序 2 “甘油梯度離心” 中介紹的方法采用 m3G 洗脫 17S U2 snRNP 并進行分析。
(5) 按程序 2 “甘油梯度離心” 的步驟 (3) 的方法再生親和柱。
