實驗方法原理 RNA 足跡和修飾干擾分析（RNA footprinting and modification interference analysis）是用來研究 RNA 與蛋白質相互作用的技術。RNA 測序及其結構分析的原理是 RNA 足跡試驗的理論基礎，它們都是建立在變性、半變性或自然條件下采用堿基特異性 的試劑來切割用放射性同位素標記了末端的 RNA 的方法之上。
實驗材料 蛋白酶 KNTPαS 復合物
試劑、試劑盒 RNA 酶抑制劑RNase T1RNase V1RNase T2苯胺檸檬酸乙醇硫酸鐵銨抗壞血酸鈉EDTANaAc硫脲焦碳酸二乙酯N-乙基-N-亞硝基脲硫酸二甲酯無水肼
儀器、耗材 硅烷化離心管
實驗步驟
一、材料與設備
1. RNA 酶抑制劑 ( RNasin 等）。
2. RNase T1。
3. RNase B.cereus ( Bc )。
4. RNase V1。
5. RNase T2。
6. 蛋白酶 K。
7. 重蒸酚、酚：氯仿 ( 體積比為 1：1 ) 和氯仿。
8. 苯胺。
9. NTPαS 復合物（New England Nuclear-Dupont 公司）。
10. 0.5 ml 和 1.5 ml 的硅烷化離心管。
11. 0.1 mol/L 檸檬酸。
12. 乙醇。
13. 0.4 mol/L 硫酸鐵銨（ammonium iron sulfate )。
14. 2 mol/L 抗壞血酸鈉。
15. 0.8 mmol/L EDTA ( pH 8.0 )。
16. Fe-EDTA。
17. 0.6% 的 H2O2（V/V）。
18. 0.3 mol/L NaAc（pH 3.8）。
19. 20 mmol/L 硫脲（thiourea )。
20. 焦碳酸二乙酯（DEPC )。
21. N-乙基-N-亞硝基脲（小心操作，強致癌性）。
22. 硫酸二甲酯 ( DMS )。
23. 3 mol/L NaAc（pH 4.5）。
24. 200 mmol/L NaBH4。
25. 無水肼。
26. 純凈的雙蒸苯胺，使用前在氮環境下重蒸并避光儲存在 -20℃ 氮環境中。
27. 1-丁醇。
28. 1%（m/V）十二烷基硫酸鈉（SDS )。
29. DEPC 處理 H2O：1 ml DEPC 加到 1 L 水中，劇烈振蕩放置過夜，高壓滅菌。
30. 10X RNA-蛋白結合緩沖液：依據分析的蛋白不同而不同，詳見注意事項。
31. 小牛肝 tRNA：37°C 同 50 μg/ml 的蛋白酶 K 孵育 2 h，抽提，乙醇沉淀，重新溶解使終濃度 10 mg/ml。
32. 1.5X 凝膠上樣緩沖液：10 mol/L 尿素，1.5X TBE，0.015% ( m/V）溴酚藍，0.015% ( m/V ) 二甲苯青，1% SDS，過濾除菌并儲存在 -20℃。
33. 10X 羥基緩沖液：50 mmol/L NaHCO3/Na2CO3（pH 9.2），1 mmol/L EDTA ( pH 8.0 )，過濾除菌并儲存于 -20°C。
34. 2X 抽提緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4)，300 mmol/L NaCl，0.05 % NP-40，10 μg/ml tRNA，1% SDS，過濾除菌并儲存于 -20℃。
35. 2X 羥基終止/抽提緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4)，300 mmol/L NaCl，0.05% NP-40，10 μg/ml tRNA，1% SDS，20 mmol/L 硫脲，過濾除菌并儲存于 -20℃。
36. 新飽和的 N-乙基-N-亞硝基脲（N-ethyl-N-nimxsoure，ENU ) 溶液：將過量的 ENU (小心操作，強致癌性 ) 加入到 100 μl 乙醇中，離心除去未溶解的 ENU，上清用做堿基修飾試劑。
37. 10X ENU 修飾緩沖液：500 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0)，10 mmol/L EDTA，過濾除菌并儲存于 -20℃。
38. I2 儲存液：用乙醇配制成 10 mmol/L。
39. 2X 硫酸二甲酯抽提緩沖液：50 mmoI/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，300 mmol/L NaCl， 0.05% NP-40，10 μg/ml tRNA，1% SDS，125 mmol/L 巰基乙醇，過濾除菌并儲存于 -20℃。
40. 肼/0.5 mmoI/L NaCl 和肼/3 mmol/L NaCl：將 NaCl 溶解在無水的肼中配制成合適的濃度。
二、操作方法
要成功的進行 RNA-蛋白相互作用的足跡和修飾分析試驗，必須首先建立特異 RNA-蛋白相互作用的條件并了解它們的結合特點。核酸酶足跡通常能得到 RNA-蛋白復合物的低分辨率信息，核酸酶在較為廣泛的條件包括在生理條件下都有明顯的活性，而化學修飾試劑在某些情況下則要求更為嚴格的條件。然而核酸酶相對較大，其活性可能受到鄰近堿基的影響，化學探針遠遠小于核酸酶，接近于溶劑大小，所以對 RNA-蛋白的相互作用能夠提供更精細的信息，為了能全面的了解 RNA-蛋白質相互作用特點，最好的手段是首先釆用核酸酶定位相互作用的位點，然后釆用化學探針和修飾干擾分析來研究相互作用的方式。
進行修飾干擾研究，首先必須有一種可靠的方法從 RNA-蛋白結合反應液中分離 RNA-蛋白復合物，通常采用凝膠遷移分析、濾膜結合（filter bonding）和免疫共沉淀方法來分離 RNA-蛋白復合物，關鍵是不能破壞 RNA 與蛋白質之間的結合。本實驗要求使用 經凝膠純化后僅有一端被標記的 RNA。末端標記適合于小于 200 個核苷酸或者相互作用的區域在 200 個核苷酸之內的 RNA 分子，對于大于 200 個核苷酸或者是相互作用的區域在 200 個核苷酸以上的 RNA 分子，最好采用反轉錄酶進行引物延伸來鑒定切割位點。
1. RNA 酶足跡分析
RNA 酶足跡分析可以給出與蛋白質相互作用的 RNA 區段的低分辨率的圖譜，在進行足跡反應以前，要確定核酸酶的濃度以便使大約 10 個 RNA 分子中只有一個被切割，這可以通過在 RNA-蛋白結合緩沖液中采用不同的酶濃度和不同的切割時間來實現。現在有一系列位點特異 RNA 酶可以用來進行 RNA 足跡，例如進行病毒相關的（VA ) RNA1 和雙鏈的 RNA 依賴的蛋白激酶（PKR ) 的足跡試驗，RNase T1 ( 0.00012 U/5 μl 反應體系），T2 ( 0.003 U/5 μl 反應體系）和 Bc ( 0.25 U/5 μl 反應體系）用來進行單鏈區的作圖，RNase V1 ( 0.006 U/5 μl 反應體系）用來進行結構區的作圖，RNase V1 可以識別 4 到 5 個或更長核苷酸形成的短的螺旋區，因此常被使用。大約 50~100000 計數/反應（用 Cerenkov 計數法測定）的 5' 或 3' 末端標記的 RNA 足夠進行幾個凝膠電泳和保持較短的放射自顯影時間。
(1) 對于實驗中所使用的每一種核酸酶進行如下反應：設置沒有 RNase 的對照，對于每一種酶使用―系列的濃度，在有 MgCl2 （自然狀態）或無 MgCl2（半變性狀態）條件下進行實驗，RNase V1 例外，因為該酶活性的發揮必須有 Mg2+ 的存在。
(2) 每一個反應加 1 μl 10X 結合緩沖液，1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA，末端標記的 RNA，1 μl 稀釋的 RNase，加 DEPC-H2O 到終反應體積 5 μl，在 37℃ 孵育 15 min，然后加入 1 μl 10 mg/mg tRNA 和 10 μl 的 1.5X 凝膠點樣緩沖液。
(3) 用 10X RNase T1 68℃（變性條件）消化 5 min，使每一個 G 都被切割，產生一個測序梯帶。
(4) 采用強堿裂解產生以一個堿基遞增的水解梯帶：1 μl 10X 羥基緩沖液，1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA，末端標記的 RNA，加 DEPC-H2O 至終體積 10 μl，在 90℃ 孵育 2 min，加入 1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA、10 μl 0.1 moI/L 的檸檬酸和 24 μl 1.5X 凝膠點樣緩沖液終止反應。
(5) 用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離產物，對于長的 RNA 可能需要進行幾個不同濃度和不同時間的電泳。
(6) 標記的 RNA 可以直接采用放射自顯影或者是磷屏檢測。進行放射自顯影時，將凝膠放在 X 射線片上，用塑料膜包裹，置于暗盒中于 -80°C 進行 X 射線片的放射自顯影，如進行磷屏檢測時，將凝膠放在 3 M 的 Whatman 紙上，用塑料膜包好，真空干燥，在室溫條件下進行磷屏成像。
(7) 確定酶解的條件，使加入的 RNA 有 90%~95% 不會被切割，這有利于下一步的足跡實驗。
(8) 在進行凝膠分析之前，應除去反應體系中的蛋白組分。用 DEPC-H2O 稀釋反應液到 200 μl，加入 200 μl 的 2X 抽提緩沖液再次分離 RNA，加入等體積的酚：氯仿，振蕩幾分鐘，混勻，用小塑離心機最高速度離心 10 min ( 約 16000 g )，收集上層水相。如前所述加入等體積的氯仿再次抽提，用 2.5 倍體積的乙醇沉淀 RNA，置干冰/乙醇中 10~20 min，4℃ 16000 g 離心 15 min，用預冷的 70% 乙醇洗滌沉淀，用 5 μl 水與 10 μl 1.5X 點樣緩沖液重新溶解沉淀。
(9) 沒有蛋白的酶解反應液也要同時進行再次抽提和沉淀，為了便于分析，上樣時應保持大致相同的量，包括作為對照的抽提后沒用核酸酶消化的蛋白-RNA 復合物。
2. 采用對核糖骨架鏈特異的試劑進行足跡和干擾分析實驗
除了化學探針相對較小能夠給出相互作用位點更高的精確度以外，使用化學探針進行足跡分析和使用核酸酶進行足跡分析的原理相同。
(1) 羥基
羥基具有中性電荷，是用作化學足跡分析的最小物質，它半衰期短，通常采用序列不依賴的方式對核糖的 1' 或 4' 位進行切割，羥基對雙鏈和單鏈的 RNA 具有相同的作用，但是核糖骨架鏈參與的高級結構對切割效率會有影響。這種切割反應比較溫和，能夠在 廣泛的緩沖液、鹽、溫度和酸堿度條件下進行。與先前的試驗一樣，在進行 RNA-蛋白復合物的足跡實驗以前需要在結合緩沖液中確定切割的條件。
① 準備過濾除菌的 0.4 mol/L 硫酸鐵銨，2 mol/L 抗壞血酸鈉，0.8 mmol/L EDTA pH 8.0，0.6% H2O2。將 0.4 mol/L 硫酸銨稀釋至 0.4 mmol/L，然后同等體積的 0.8 mmol/L EDTA 混合，稀釋 2 mol/L 抗壞血酸鈉至 20 mmol/L，然后與等體積的 Fe-EDTA 混合物和等體積的 0.6% H2O2 混合。
② 首先在沒有蛋白質的條件下消化 RNA 確定得到適當的切割梯帶的條件，通過控制加入離子/EDTA/H2O2 混合物的量來調節切割的效率，對于 VA RNA1 最適的條件是等量的消化液加入到結合反應液中，室溫下孵育 2 min。
③ 用 DEPC-H2O 稀釋反應液至 200 μl，然后迅速加入等體積含有 20 mmol/L 硫脲 ( 羥基消除劑）的 2X 抽提緩沖液終止反應，采用1 “RNA 酶足跡分析” 中第 (8) 步的方法重新回收 RNA。
④ 建立了消化條件后，比較 RNA-蛋白復合物和未結合的 RNA 的切割情況，采用前面所述的方法分析所得到的結果。
(2) N-乙基-N-亞硝基脲
N-乙基-N-亞硝基脲（ENU ) 是一種溫和的烷化試劑，能夠使骨架鏈上的磷酸形成磷酸丙酯，這些修飾可以被溫和的堿基試劑識別及切割，通過測定未結合的 RNA 來確定反應時間和使用的 ENU 量，建立合適的修飾條件，盡管這種修飾沒有位點特異性，而且 RNA 主鏈參與的高級結構可能對反應產生影響，但是 ENU 能夠用于足跡和修飾干擾分析試驗。
① 加 2 μl 10X 結合緩沖液，1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA，末端標記的 RNA 或者 RNA-蛋白質復合物，5 μl 新鮮配制飽和 ENU，加水到 20 μl，37℃ 孵育 30 min。用水稀釋至 200 μl，加入等體積的酚：氯仿，振蕩幾分鐘混勻，用小型離心機在最高速度離心 10 min ( 約 16000 g )，收集上層水相，如前所述加入等體積的氯仿再次抽提，用 2.5 倍體積的乙醇沉淀 RNA，在干冰/乙醇里孵育 10~20 min，4℃ 16000 g 離心 15 min，用冰預冷的 70% 乙醇洗滌沉淀。同時用 5 μl 乙醇代替 ENU 作為空白對照。
② 重新溶解 RNA 沉淀于 200 μl pH 3.8 的 0.3 mol/L NaAc 中，然后加入 600 μl 乙醇，在干冰/乙醇里孵育 10~20 min，于 4℃ 16000 g 離心 15 min，用冰預冷的 70% 乙醇洗滌沉淀。
③ 新溶解 RNA 到 10 μl 的 100 mmol/L 的 Tris-HCl ( pH 9.0) 的溶液中，在 50℃ 孵育 5 min，乙醇沉淀 RNA 并進行變性凝膠電泳分析。
④ 如果要預先對 RNA 修飾進行干擾分析，在第 (1) 步中使用 10X ENU 修飾緩沖液并在 80℃ 孵育 2 min。
(3) 含有硫代磷酸酯的轉錄物
NTPαS 的 Sp 非對映異構體是噬菌體 RNA 聚合酶的底物，能夠與正常的 NTP —樣攙入到合成的 RNA 中，硫代磷酸酯（phosphorothioate）對碘/乙醇敏感，可以被其切割，由于碘不帶電荷、非常小、反應迅速并且對電泳遷移率沒有影響，因此適合足跡試驗。這可以作為 ENU 修飾的替代，一來可以加快反應的時間，二來在解釋數據時不必進行 RNA 酶測序和降解梯帶。
① 合成含有硫代磷酸酯的轉錄物，進行末端標記并純化，另外對每一個核苷酸和 0.2 mmol/L （5%）NTPαS 進行一個單獨的轉錄反應，也就是說，對于一個含有 AαS 的轉錄物必須含有所有的 4 種 NTP，但是也要用 0.2 mmol/L 的 ATPαS 進行一個單獨的轉錄反應。
② 將未結合的 RNA 和 RNA-蛋白復合物在室溫下與 1 mmol/L I2 孵育 2 min，進行硫代磷酸酯基閉的切割，同時采用等量的乙醇作對照反應。
③ 用 DEPC-H2O 稀釋反應液至 200 μl，加入等體積的抽提緩沖液再次分離 RNA，加入等體積的酚：氯仿，振蕩幾分鐘，混勻，用小型離心機在最高速度離心 10 min ( 約 16000 g），收集上層水相，如前所述加入等體積的氯仿再次抽提，用 2.5 倍體積的乙醇沉淀 RNA，在干冰/乙醇里孵育 10~20 min，于 4℃ 16000 g 離心 15 min，用冰預冷的 70% 乙醇洗滌沉淀，用 5 μl 水和 10 μl 1.5X 點樣緩沖液重新溶解沉淀。
④ 在此試驗中，由于針對特異的 NTPαS 的切割使得末結合的 RNA 形成測序梯帶，從而使凝膠的分析更為容易。
3. 采用堿基特異的試劑進行足跡和干擾分析實驗
2 “采用對核糖骨架鏈特異的試劑進行足跡和干擾分析實驗” 中介紹的方法可以對與 RNA 主鏈作用的蛋白進行研究，然而 RNA 的其他部分如堿基也可以調控特異的 RNA-蛋白相互作用，目前有許多化學試劑可以用來進行試驗以獲得這些堿基的信息。
(1) 焦碳酸二乙酯
焦碳酸二乙酯（DEPC ) 可以使嘌呤 (A>>G ) 的 N-7 位發生羧乙基化，這種修飾可以被堿基堆積抑制同時也受溶液中二價離子的調節。首先要滴定探針的濃度，此處介紹的操作條件和步驟適合于 VA RNA1。
① 加 2 μl 10X 結合緩沖液，1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA，末端標記的未結合 RNA 或者蛋白 RNA 的復合物，2 μl DEPC，加水到 20 μl，37℃ 孵育 10 min。用水稀釋到 200 μl，加入等體積的酚：氯仿，振蕩幾分鐘混勻，用小型離心機在最高速度離心 10 min ( 約 16000 g )，收集上層水相，如前所述加入等體積的氯仿再次抽提，用 2.5 倍體積的乙醇沉淀 RNA，在干冰/乙醇里孵育 10~20 min，于 4℃ 16000 g 離心 15 min，冰預冷的 70% 乙醇洗滌沉淀。
② 如果要產生 DEPC 測序梯帶或者對用來進行干擾分析的 RNA 進行預先修飾，可將 2 μl DEPC、末端標記 RNA、1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA、3.3 μl 3 mol/L 的 NaAc ( pH 4.5 )、1 μl 200 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 混合，加水至終體積 200 μl，90°C 孵育 2 min，加入 25 μl 的 3 mol/L NaAc ( pH 4.5）和 750 μl 乙醇，回收、沉淀 RNA。
③ 第 (1) 步或者第 (2) 步沉淀的 RNA 用 200 μl 0.3 mol/L 的 NaAc ( pH 3.8) 重新溶解，加入 600 μl 乙醇沉淀 RNA。這些 RNA 可以用作干擾分析、進行修飾位點的切割或變性凝膠電泳。
(2) 硫酸二甲酯
硫酸二甲酯（DMS ) 能夠使鳥嘌呤（N7 )、胞嘧啶（N3 )、腺嘌呤（N1 ) 的 N 甲基化，只有 G 和 C 的修飾可以采用 Krol 和 Carbon 所述的堿基切割方法檢測到。G-N7 反應可以被堿基堆積抑制，而 C-N3 的反應則可被堿基配對所抑制，此處的條件適合于 RV RNA1。
① 加 20 μl 10X 結合緩沖液，1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA，末端標記的未結合 RNA 或者蛋白與復合物，加水至 200 μl，加 0.5 μl DMS 于 37℃ 孵育 10 min。
② 如1 “RNA 酶足跡分析” 中步驟 (8) 的方法，使用含有 125 mmol/L 的 β-巰基乙醇 2X DMS 抽提緩沖液回收 RNA。
③ 要產生一個 DMS 的測序梯帶或者適合干擾分析的預先修飾的 RNA，可將 1 μl 的 DMS、末端標記的 RNA、1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA、3.3 μl 3 mol/L 的 NaAc ( pH 4.5)、1 μl 200 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ) 混合，加水至終體積 200 μl，于 90°C 孵育 1 min。
④ 加入 25 μl 3 mol/L NaAc ( pH 4.5 ) 和 750 μl 乙醇，回收、沉淀 RNA。
⑤ 第 (1) 步或者第 (2) 步沉淀的 RNA 用 200 μl 0.3 mol/L 的 NaAc ( pH 3.8 ) 重新溶解，加入 600 μl 乙醇沉淀 RNA。這些修飾的 RNA 可以用作干擾分析或者重溶在 100 μl 水中，分為兩份，真空干燥。
⑥ 重新溶解一份在 10 μl 1 mol/L Tris-HCl 中，加入 10 μl 新鮮配制的 200 mmol/L NaBH4， 避光在冰上孵育 30 min，進行 G-N7 位點的切割。
⑦ 重溶另一份在 10 μl 冰預冷的 50% ( V/V ) 無水肼中，冰浴 5 min，進行 C-N3 位點的切割。
⑧ 第 (4) 步或者第 (5) 步沉淀的 RNA 用 200 μl 0.3 mol/L NaAc ( pH 3.8 ) 重新溶解，加入 600 μl 乙醇沉淀 RNA，重復溶解沉淀一次，RNA 用來進行苯胺的切割。
(3) 苯胺切割修飾的 RNA
① 重新溶解 RNA 沉淀在 20 μl 1 mol/L 苯胺（用 0.3 mol/L pH 3.8 NaAc 新鮮稀釋），避光于 60℃ 孵育 20 min。
② 加入 1.4 ml 正丁醇終止反應，短暫振蕩，室溫下在微型離心機上以最高轉速離心 ( 約 16000 g )，小心去除正丁醇，重新溶解 RNA 沉淀在 150 μl 1% ( m/V ) SDS 中，加入 1.4 ml 正丁醇，短暫振蕩，如前沉淀 RNA。
③ 用無水乙醇洗滌沉淀，完全干燥，重新溶解 RNA 沉淀于 4 μl DEPC-H2O 和 8 μl 的 1.5X 凝膠點樣緩沖液，樣品準備進行凝膠分析。同時還需用苯胺處理標記的未修飾的 RNA。
4. 修飾干擾分析
使用預先修飾的 RNA 進行修飾干擾分析可以鑒別與蛋白質相互作用的重要位點。DEPC、ENU、DMS 修飾的 RNA 和含有硫代磷酸酯的轉錄物都可以進行干擾分析。在變性條件下對 RNA 進行化學試劑的修飾可能使所有的位點都被修飾，對修飾后的 RNA 進 行回收并進行結合反應。RNA 蛋白復合物從未結合的 RNA 中分離出來，如前所述進行蛋白-RNA 復合物的抽提。這些 RNA 在修飾位點進行切割，平行進行未修飾的 RNA 試驗以便產生一個測序梯帶對照，未修飾的 RNA 也作為沒有特異結合的對照，采用變性凝膠電泳和放射自顯影對產物進行分析。下面給出了采用肼分析嘧啶堿基的修飾程序。
肼可以去除嘧啶堿基用來進行干擾分析，根據選擇的條件不同，反應可以針對 U、C 或者二者進行，此處的條件適合于 VA RNA1。
1. 沉淀未端標記的 RNA 和 1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA。
2. 進行 U 特異的反應，重溶 RNA 于 10 μl 的水中，并加入 10 μl 無水肼，在冰上孵育混合物 10 min。
3. 進行 U 和 C 特異的反應同上面所述的相同，只是將 RNA 沉淀重溶在 20 μl 新鮮配制的無水肼/0.5 mol/L NaCl 中，冰上孵育 30 min。
4. 進行 C 特異的反應，將 RNA 沉淀重溶在新鮮配制的無水肼/3 mol/L NaCI 中，冰上孵育 30 min。
5. 第 2、3、4 步沉淀的 RNA 用 200 μl 0.3 mol/L NaAc ( pH 3.8) 重新溶解，加入 600 μl 乙醇沉淀 RNA，重新溶解沉淀一次，回收沉淀用于干擾結合研究和苯胺切割試驗
