實驗方法原理 酵母三雜交系統（yeast three-hybrid system）可用于分析蛋白質與 RNA 間的相互作用。在酵母三雜交系統中，RNA 蛋白質相互作用導致報道基因的轉錄，可以通過細胞生長、克隆顏色或特異的酶活性檢測蛋白質與 RNA 的相互作用。
試劑、試劑盒 YPD 和 SD 培養基鮭精 DNAPEG 3350TE 緩沖液LiAc DMSOZ 緩沖液
實驗步驟
一、引入 RNA 質粒和 cDNA 文庫
通常首先將 RNA 質粒轉化到宿主菌株-L40coat 內，得到包含 RNA 質粒的細胞，再轉化一個融合了轉錄激活區的 cDNA 文庫（雜交 RNA 對宿主細胞幾乎沒有毒性，與用于雙雜交篩選的一些雜交蛋白誘餌不同，所以，沒必要將兩個質粒共轉染），轉化混合物鋪于缺乏亮氨酸和組氨酸的培養基上，不需要保持 RNA 質粒（如 ADE2 或者 URA3 選擇）。這樣就允許細胞在沒有 RNA 或丟失 RNA 質粒的情況下激活 HIS3，能夠利用克隆顏色篩選。
下面是簡便的酵母感受態細胞制備方法和質粒與文庫的轉化方法。
1. 酵母感受態細胞的制備（LiAc 法）
需要準備的試劑包括：YPD 和 SD 培養基；各種缺陷型氨基酸添料：鮭精 DNA ( 10 mg/mL，用前需 100℃ 變性 20 min，而后立即置冰上）；50% PEG 3350；TE 緩沖液； LiAc ( 1 mol/L，pH 7.5）；DMSO。
(1) 提前 2~3 天將酵母菌轉接一次至相應的培養板上（YPD），一周內可用。
(2) 挑幾個直徑 2~3 mm 的克隆接入含 10 ml YPD 的大試管，劇烈振蕩，打散。
(3) 于 30℃，230~270 r/min 培養 16~18 h，培養至 OD600 ＞1.5。
(4) 將過夜培養物轉接至含 200 ml YPD 的三角瓶中，培養至 OD600 為 0.2~0.3。
(5) 于 30℃，230~270 r/min 振蕩培養 3 h，培養至 OD600 為 0.4~0.6。
(6) 將培養物分裝至 50 ml 離心管中，于室溫 2200 r/min 離心 5 min。
(7) 棄上清，加入 25~50 ml 無菌水或 TE 重懸。
(8) 于室溫 2200 r/min 離心 5 min。
(9) 棄上清，加入 1 ml 新鮮配制的無菌 1XTE/LiAc 重懸。至此感受態細胞制備完成。
2. 質粒/文庫的轉化
(1) 準備 PEG/LiAc 溶液 10 ml。
(2) 將質粒或文庫 DNA 與鮭精 DNA 混勻，加入 0.1 ml 感受態細胞，振蕩混勻。
(3) 加入 0.6 ml PEG/LiAc，振蕩混勻。
(4) 于 30℃，200 r/min 振蕩培養 30 min。
(5) 加 70 μl DMSO，上下顛倒，溫和混勻。
(6) 于 42℃ 水浴熱激 15 min。
(7) 置冰上 1~2 min。
(8) 于 14000 r/min 室溫離心 5 s。
(9) 棄上清，用 0.5 ml TE 重懸酵母細胞。
(10) 涂板，于 30°C 培養約 3~4 天長出菌落。
需要說明的是，可以把 HIS3 基因的一種產物的競爭性抑制劑-3-氨基三唑（3-AT）加到平板中以選擇更強的相互作用。一些 RNA 可自身微弱地激活報道基因，許多蛋白也可不依賴雜交 RNA 而微弱地激活報道基因，這兩種情況都產生 “假陽性”。為了消除由 RNA 誘餌產生的激活，在起始轉化之前，應該用一個只攜帶 RNA 質粒的菌株來滴定 3-AT。為了減少蛋白假陽性的數量（“RNA 非依賴的” 陽性），在 2~5 mmol/L 范圍內的 3-AT 是一個好的起始點，它們提供了一個抑制背景和允許 “真” 陽性生長之間合理的平衡。RNA-蛋白相互作用的親和性在體外的數據對于決定應該便用的 3AT 濃度有參考價值。在一個與其 RNA 靶標體外相互作用很強的 SLBP 的篩選中，含 25 mmol/L 的 3-AT，可大大降低背景。
二、通過克隆顏色去除不依賴 RNA 的假陽性
從起始轉化中可得到兩類陽性。一類轉化需要雜交 RNA 激活 HIS3 報道基因，這些稱作 “RNA依賴的”。第二類陽性在雜交 RNA 存在或不存在時都可激活 HIS3，這些稱作 “RNA 非依賴的”。RNA 非依賴的陽性可能攜帶能結合報道基因啟動子區的蛋白，或可直接與 Lex A-MS2 包裝融合蛋白相互作用，這種 RNA 非依賴的轉化可能非常多，甚至占所有克隆數的 95% 以上。
為了去除 RNA 非依賴性的假陽性，我們采用了在 RNA 質粒上接 ADE2 基因的方法。宿主菌株是一個 ade2 的突變體。當培養板中腺苷酸水平變低時，細胞幵始合成腺苷酸，并且因為缺少 ADE2 編碼的酶而積累一種紅色的嘌呤代謝物，此積累使細胞呈現粉紅色或者紅色，而攜帶野牛型 ADE2 基因的細胞是白色的。
在起始轉化中，只選擇激活 HIS3，而不是保持 RNA 質粒，對于 RNA-依賴的陽性，HIS3 選擇不是直接選擇攜帶 ADE2 基因的 RNA 質粒；因此這些轉化子是白色的，如果它們繼續在沒有外源 His 的條件下生長將保持這樣。然而，非依賴的陽性不需要 RNA 質粒激活 HIS3 基因，這樣就可能失去以每個世代百分之幾頻率工作的質粒，所以這些假陽性生成粉紅菌落或部分粉紅的白色菌落。
起始的轉化平板通常在 30℃ 培養一周。這段時間允許陽性克隆積累 HIS3 基因產物和生長，并且提供了足夠的時間產生顏色。如果一周后粉紅色不濃，4℃ 過夜可增強效果。棄去粉紅色或者部分粉紅的克隆，挑選完全的白色菌落進一步分析。我們通常選擇所有白色菌落 ( 典型的為幾個大的，很多小的克隆），并且再次在選擇性培養基上選擇包含 cDNA 質粒和 RNA 質粒的克隆。多數小的白色克隆是 RNA 非依賴的，不能生長。能在選擇培養基上生長的白色克隆用來進一步分析。
用克隆顏色來識別 RNA 依賴的陽性并不完美，許多 RNA 非依賴的陽性能被識別并棄掉。多數白色克隆可能是 RNA 非依賴的。在 E.coli 中復蘇質粒之前從白色克隆中嚴格除掉剩下的 RNA 非依賴的激活子是非常重要的。
三、β-Gal 活性分析
為了確證包含 cDNA 的白色克隆通過酵母三雜交激活，需要檢測 lacZ 基因的表達水平。在 L40coat 菌株中，lacZ 基因整合到染色體上，位于 Lex-A 結合位點的控制下。
β-Gal 活性分析可以通過檢測乳糖轉變為發光產物來分析，用浸在濾紙上的克隆或細胞裂解液來進行分析。濾紙測定法能產生定性結果，而液體測定法更能定量分析。
需要準備的試劑包括，Z 緩沖液：60 mmoI/L Na2HPO4·7H2O，40 mmol/L NaH2PO4·H2O，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgSO4·7H2O，50 mmol/L β-巰基乙醇，調 pH 至 7.0，高壓滅菌；Z 緩沖液/X-Gal 溶液：100 ml Z 緩沖液，0.27 ml β-巰基乙醇，1.67 ml X-Gal 儲液。
1. 定性（濾紙）測定法
(1) 從步驟二 “通過克隆顏色去除不依賴 RNA 的假陽性” 劃克隆至合適的選擇性培養基（SD-Leu-Ura）上，并培養過夜。
(2) 復制克隆至平板大小的硝酸纖維素膜或濾紙上（Whatman，3 MM )。
(3) 液氮中處理 20 s。
(4) 菌落面朝上，室溫溶解濾膜（大約 2 min )。
(5) 剪幾張與皮氏培養皿大小一致的濾紙，濾紙用 Z 緩沖液/300 μg/ml X-Gal 飽和，X-Gal 應使用新鮮的，去除多余的緩沖液。
(6) 將濾膜放在浸透的濾紙上，用封口膜封平板。
(7) 30℃ 孵育過夜，定期檢査濾膜，觀察顏色改變。
強的相互作用 ( 如 TRE 和 IRP ) 會在 30 min 內變藍，弱的相互作用如果延長孵育時間最終也會產生藍色。由于這個原因，有規律的檢查濾膜以確定花費多長時間出現顏色是很重要的。
2. 定量（液體）測定法（ONPG 法）
β-Gal 的特異活性在酵母細胞裂解液中，可以使用不同的底物來測定。通常采用 ONPG 或 CPRG ( 氯酚紅-D-半乳糖吡喃糖苷) 比色法分析，CPRG 更為敏感，但較昂貴。另外發光底物提供了高敏感性，且并不貴。下面方法應用了發光底物-Galacton-Plus ( Tropix，Bedford，MA），這種分析需要檢測發光的裝置。下面的操作方法適用于 Monolight 2010 發光儀（Analytic Luminescent 實驗室，CA )。這種分析的細節，如樣品量，隨使用儀器的不同而不同。
(1) 對每組待測的相互作用，均培養 3 份酵母單菌落至 5 ml 選擇性培養基（SD/Leu Trp His）中，于 30℃，230~250 r/min 搖過夜。
(2) 培養至 OD600 值約為 0.8。
(3) 對于每組相當于 1.0 OD 細胞的沉淀，用 100 μl 裂解緩沖液（100 mmol/L 磷酸鉀，pH 7.8，0.2% Triton X-100 ) 重懸。
(4) 凍融裂解細胞。液氮浸 30 s 后，37°C 放置 90 s，連續 3 個循環。
(5) 取 100 μl 菌液加入 1.5 ml 離心管，同時設空白對照管（100 μl Z 緩沖液）。
(6) 簡單混旋各管。
(7) 于 12000 g 離心。
(8) 收集上清進行發光分析，如果有必要，可將樣品于 -70°C 保存。
(9) 加 10 μl 裂解物到發光儀的試管中。對于強的相互作用，有必要稀釋裂解液以保證在線性范圍內分析。
(10) 用反應緩沖液（100 mmol/L 磷酸鈉，1 mmol/L 氯化鎂，pH 8.0）1：100 稀釋 Galacton 底物。每個發光儀試管中加 100 μl。
(11) 25℃ 孵育 60 min。
(12) 直接用發光儀測定發光情況。
(13) 用 Bradford 或同等方法測定裂解液中蛋白濃度。
(14) 蛋白濃度對化學發光標準化，得到特異的活性。
四、純化 RNA 質粒再次檢測
在步驟二 “通過克隆顏色去除不依賴 RNA 的假陽性” 中利用克隆顏色篩選可以消除絕大多數但并非全部不依賴 RNA 的假陽性。為了確定陽性確實為 RNA 依賴的，RNA 質粒需要 URA3 抗性篩選。然后檢測報道基因的表達，對不能激活報道基因的候選分子進一步分析。
為了篩選掉丟失 RNA 質粒的細胞，可將細胞鋪在含有 5-FOA ( 5-fluorouracil acid）的培養板上。5-FOA 可被 URA3 基因的產物轉變為具有毒性的 5-fluorouracil。缺乏 URA3 基因產物的細胞可以在含有 5-FOA 的培養板上生長，而含有 URA3 基因產物的不能。
1. 從步驟二 “通過克隆顏色去除不依賴 RNA 的假陽性” 中挑選陽性克隆到 SD-Leu 平板、生長一天使細胞丟失質粒。
2. 復制至 SD-Leu 含 0.1% 5-FOA 的平板，30℃ 孵育幾天。
3. 長出的細胞劃線至 SD-Ura 平板上以確定 RNA 質粒的丟失。通過簡單的 5-FOA 抗性篩選通常是有效的。
4. β-Gal 活性分析。
RNA 質粒上的 ADE2 標記在檢測 RNA 質粒丟失中是有用的。丟失 RNA 質粒的細胞幾天后可變為粉色。如果陽性克隆數較少，就可不用較貴的 5-FOA，細胞就可直接于富營養培養基中培養過夜，然后鋪于 SD-Leu 平板上。幾天后一些克隆將變粉色或部分粉色。均一粉色的克隆即丟失了 RNA 質粒，可以再作 β-Gal 活性分析。
五、用突變和對照 RNA 確定結合的特異性
為了確定 RNA 結合的特異性，重新將編碼不同雜交 RNA 的質粒導入菌株，如果陽性克隆較少，可以將不同的 RNA 質粒轉化入菌株，其余一般用交配法導入質粒，可以用 R40 coat 菌株。下面是簡單的交配法的操作方法。
1. 在 SD-Ura 平板上培養攜帶特異雜交 RNA 質粒（如突變型對野生型）的 R40coat 轉化子菌落。
2. 劃格法從 5-FOA 平板復制 Ura 克隆至 YPD 平板。
3. 將每個 R4coat 菌落復制至同一個 YPD 平板。
4. 于 30℃ 培養過夜進行交配。
5. 復制平板到 SD-Leu-Ura 平板上選擇二倍體。
6. β-Gal 活件分析。
RNA 用于特異性分析。步驟四 “純化 RNA 質粒再次檢測” 存活的陽性克隆帶有相對于細胞 RNA 優先結合雜交 RNA 的蛋白。雖然這些陽性識別雜交 RNA 的一些特點，它們不一定是與生物活性相關的因子。因此，理想的對照是精細的突變影響生物功能或以序列特好的方式影響相互作用。在一些情況下，反義誘餌可以用來做二級結構或堿基組成的對照。
真正 RNA 依賴的陽性克隆的分級。最初，陽性克隆分級生理上的相關性是不可預測的，因為蛋白的功能很多（在隨機篩庫時），相互作用的強度，在起始轉化中用的 3-AT 的濃度，以及其他參數等。
沒有微小的 RNA 突變可用怎么辦？必須設計另外的方法來鑒定這些陽性克隆。很顯然，功能測試是理想的，但在很多組織和系統中，這是費時又費力的。cDNA 序列可以通過直接與已知 RNA 結合蛋白或預期的分子質量（基于如 UV 交聯獲得）對比，獲得信 息。由于毎種情況都是特異的，我們就不在這里提供通用的討論了。然而，必須提醒的是二次篩選是很關鍵的。
六、鑒定陽性 cDNA
1. 從酵母細胞中提出顯示出預期 RNA 結合特異性的 cDNA 質粒，轉化到 E.coli 中。酵母細胞可能包含多種 cDNA 質粒，只有其中一種編碼的蛋白結合 RNA。因此，應該從多個 E.coli 轉化子中提取出質粒，重新轉入酵母以保證獲得正確的質粒。下面是一個簡單的操作方法，所有的步驟都在室溫進行。
(1) 牙簽挑酵母單克隆至 50 μl 裂解液 [ 2% Triton X-100，1% SDS，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA ]。
(2) 加 50 μl 酚：氯仿和 0.1 g 酸洗的玻璃珠。
(3) 高速混旋 2 min。
(4) 高速離心 5 min。
(5) 轉移上清至一干凈的試管中，乙醇沉淀 DNA。70% 乙醇洗后干燥沉淀。
(6) 用 10 μl 水重懸沉淀。用 1 μl 電轉化 E.coli。
2. 為了方便確定多少質粒在一個酵母轉化子中，我們通常用裂解的酵母克隆進行 PCR 擴增，用插入片段的側翼序列做引物。下面是酵母克隆進行 PCR 的操作方法。
(1) 用無菌槍頭接觸酵母克隆。
(2) 將槍頭浸泡 10 μl 反應緩沖液 [ 1.2 mol/L 山梨糖醇，100 mmol/L 磷酸鈉（pH 7.4)，2.5 mg/ml 酶解酶 ]，上下吹打幾次，于 37℃ 孵育 5 min。
(3) 取 1 μl 進行 20 μl 體系 PCR 反應。如果需要，PCR 產物可以用色譜純化或凝膠中純化后直接測序。
七、功能測試或其他篩選
通常需要其他的步驟來鑒定那些陽性克隆的生物學意義。如前面（步驟五 “用突變和對照 RNA 確定結合的特異性”）所說那些篩選都是獨特的，依賴于相互作用和研究的組織。用 RNA 誘餌的篩選中，鑒定出不相關的 RNA 結合蛋白是不奇怪的，而只是個合理的相互作用分子。