實驗材料 pBSII KS 質粒大腸桿菌 DH5α
試劑、試劑盒 Pfx 聚合酶堿性磷酸酶通用緩沖液覆蓋液剛果紅溶液脫色液樺木木聚糖底物溶液PAHBAH 儲液
實驗步驟
我們以 DNA 重組 D.thermophilum Rt46B.1 木聚糖酶基因（ xynB) 及其 5 個相關的木聚糖酶基因為例 [7]，說明 DOGS 的一般流程。圖 11.1 是整個實驗的框架圖。包括設計引物、引物延伸擴增出基因片段，然后整合這些片段，最后擴增出全長的嵌合基因（注 1)。
3.1 互補的簡并引物對可以有效地擴增基因片段并且容易將有重疊的相鄰片段連接起來
最常用的分離遠緣關系基因的方法，是根據基因中高度保守的序列，設計出簡并引物，然后通過 PCR 來分離這些基因。這個方法的難點是，隨著引物簡并性的增加以適合更多的基因，指導 PCR 反應合成的正確引物數則會降低，而且這些引物在反應最初的幾個循環就有可能被用完。此時非特異性的擴增就會在大量的沒有參與到目標基因擴增的引物存在下出現，尤其是在錯配模板過程中采用不太嚴格的退火溫度時。
為了克服簡并寡核苷酸基因改組中簡并引物存在的上述問題，Rose 等 [13] 發明了一種稱為共識-簡并寡核苷酸混合的方法（CODEHOP) 。CODEHOP 引物包含一個相對較短的簡并 Y 端和一個通用的非簡并 5' 端。3' 端長度減至最少可降低整個簡并引物庫中的引物數。簡并的 3' 端與模板的結合可以通過非簡并的 5' 端來穩定，這樣就在不需要增加文庫簡并度的情況下允許更高的退火溫度。雖然 5' 端與目標序列在最初的 PCR 循環中可發生潛在的錯配，但它們離 3' 端延伸位點比較遠，因此，錯配很少影響聚合酶延伸的起始。基因產物的進一步擴增，通過引物池中引物序列的相似性，被顯著增強；這也表明有更多的引物可被使用。DOGS 方法通過改進CODEHOP，可以更有效地擴增重疊區的基因片段。通過來自不同基因的相鄰基因片段的重疊延伸可以導致嵌合基因的生成。合適的引物序列設計，是 DOGS 方法中最重要的一環。
對 CODEHOP 方法的改進，需要很好地設計互補引物對。每個引物有一個非簡并的核心，兩邊是簡并的 5' 端和 3' 端，在這里我們稱其為互補簡并端（CDE) 引物。同 CODEHOP 中的引物一樣，簡并的 3' 端使得 CDE 引物與模板可以特異的結合，而非簡并區則可穩定接下來的 PCR 循環。簡并的 5' 端在 PCR 過程中并不促成 CDE 引物與模板的結合，它主要是用來有效的結合并重疊延伸相互分離的、分別由正向或反向 CDE 引物擴增的 PCR產物（基因片段）。
每個 CDE 引物非簡并的核心區通常是基于相應基因上的編碼序列，該基因往往是用來混編的親代基因。這可以保證嵌合的基因在重組的位點保留親代基因的序列。
3.1.1 設計和使用基因特異的巢式末端引物
( 1 ) 設計和合成用來擴增每個需要混編基因的適合的正向和反向引物。每個引物應該包含 17?20 個核苷酸基因特異性的 3' 端和包含 17?20 個核苷酸的通用 5' 端。我們在通用端引物引入酶切位點，以便定向連接 PCR 產物到 pBSII KS 載體中。
( 2 ) 合成兩個巢式引物，其序列相對于基因特異的正反向巢式引物通用端。該巢式引物將和 CDE 引物結合使用，以擴增每一基因的首末部分。
( 3 ) 用設計好的基因特異性引物擴增出每個基因，一般是從基因組中擴增，或者從其他有該基因的克隆中擴增。
3.1.2 CDE 引物特點總結
CDE 引物可以有效地擴增同源關系較小的基因中的片段。CDE 引物的 5' 的簡并端確保了通過正向和反向互補的 CDE 引物擴增出來的基因片段在接下來的重疊延伸 PCR 步驟中可以有效地退火。而且，由多個 CDE 引物產生的連續基因片段帶有適合重疊延伸和 PCR 的互補末端，從而可以產生重組的片段。圖 11.2 給出了設計 CDE 引物的一個例子，以便從相關基因中擴增基因片段以及在后續疊加延伸片段中生成嵌合體。
CDE 引物也可以與不含有非簡并核心區的互補簡并引物結合使用，通過末端互補以及重疊延伸 PCR，從而得到重組的基因片段。將這些來自相關基因的片段混合后進行重疊延伸和 PCR，可以有效地產生嵌合的基因片段。 CDE 引物的非簡并區可以（但不必須）根據一個親代基因來設計。最后，來自不同基因的片段可以不等量的混合，這樣可以控制不同片段整合產生的新基因（ 見注 2)。圖 11.3 概括了用 CDE 引物擴增和重疊延伸基因片段的流程。
3.1.3 設計 CDE 引物以保證有效的基因片段的擴增和相鄰片段的連接
( 1 ) 用合適的序列比對軟件，如 ChistalX，對相關蛋白質進行序列比對。
( 2 ) 確定保守的氨基酸基序。在我們的例子中，木聚糖酶家族的基因根據其保守的區域可以分成 8 個部分。
( 3 ) 用合適的序列比對軟件，如 Tranalign [ 15 ] ，對基因的核苷酸序列進行比對。
( 4 ) 基于保守的 DNA 序列，設計用以擴增保守位置 DNA 的 CDE 正向和反向引物。然后在適當地加入 5' 端和 3' 端的通用巢式引物的條件下，擴增出基因片段（圖 11.2)。
( 5 ) 用相鄰的 CDE 引物和通用的 5' 端和 3' 端巢式引物，擴增每個基因的每個片段。在這個例子中，PCR 反應的條件是：95°C 1 min，1 個循環；然后 95°C 30s，35°C 20s，72°C 40s，總共 35 個循環；最后 72°C 5 min，1 個循環。在 PCR 反應中使用的是古細菌 DNA 聚合酶，Platinum Pfx ( 見注3 和注4)。
( 6 ) 用膠回收每個 PCR 產物。
3.1.4 基因片段的重疊延伸
( 1 ) 每個基因的片段應當按合適的比例混合，產生基因的嵌合。例如，用 6 個候選的基因 G1?G6，其中 G1 是 D .ZiermojiiZmn Rt46B.1 基因。當決定用 G1 在基因重組中作為主要的親代基因時，每個基因的 PCR 片段則按照 8.75 倍的 G1 基因相對于等量的其他基因的比例混合，這樣，嵌合基因中平均 5/8 的基因片段來自 Rt46B.1xynB ( 注 5 給出了一個簡單的計算公式）。
( 2 ) 接下來，用 50?100 ng 的混合片段作為模板來進行重疊延伸 [16]，應用如下的 PCR 反應體系：95°C 1 min，1 個循環；然后 95°C 30s，35°C 20s，72°C 40s，總共 35 個循環；最后 72°C 5 min，1 個循環。在 PCR 反應中使用的是古細菌 DNA 聚合酶，Platinum Pfx ( 見注 3)。
3.1.5 全長嵌合基因的擴增
將重疊延伸的產物（50?100 ng，見 11.3.1.4 ) 作為模板，加入通用的 5' 端和 3' 端巢式引物，然后 PCR 便可得到全長的嵌合重組基因。PCR 的反應條件如下：95°C 1 min，1 個循環；然后 95°C 30s，50°C 20s，72°C 40s ，總共 35 個循環；最后 72°C 5 min，1 個循環。在 PCR 反應中用 Platinum Pfx 聚合酶。
3.1.6 重組基因的克隆
( 1 ) 用 Bam HI 和 Hind III 酶切 DOGS 的 PCR 產物。
( 2 ) 用 Bam HI 和 Hind III 酶切 pBSII KS-載體，然后用蝦堿性磷酸酶處理。
( 3 ) 逢接 PCR 產物與載體 pBSII KS-。
( 4 ) 將連好的載體（載體上帶有氨芐抗性）轉入到的 DH5α 菌株中，然后涂在含有 100 μg/ml 氨芐抗性和 5 mmol/L IPTG 的 LB 平板上。
( 5 ) 挑取單克隆，在新的帶有 100 μg/ml 氨芐抗性和 5 mmol/L IPTG 的 LB 平板上做一備份，然后按 11.3.1.7 節所描述的剛果紅覆蓋法（Congo Red Overlay ) [17] 來檢測木聚糖酶的表達及活性。
3.1.7 剛果紅篩選法
( 1 ) 將 4 ml 冷卻至大約 50°C 的覆蓋液加入到長有克隆的平板上。平板應該先在 37°C 預熱以確保均勻的覆蓋層的形成。
( 2 ) 當覆蓋層形成后，將平盤倒置在一個封口袋內。在 70°C 密封放置 3 h。
( 3 ) 然后取出平板，去掉袋子，放置室溫冷卻。
( 4 ) 在每個平板上加入 5 ml 剛果紅溶液，使其能全部覆蓋覆蓋層。然后放置 5~10 min。
( 5 ) 倒出剩余的剛果紅溶液，然后將平板浸潤在脫色液里脫色。
( 6 ) 未染上色的克隆是含有木聚糖酶基因陽性克隆。
圖 11. 4 為用 DOGS 方法從 6 種木聚糖酶的基因中產生重組木聚糖酶的示例（見注 6)。
3.1.8 木聚糖酶活性測定（PAHBAH 方法）
使用蛋白質抽提試劑 BPER II，在全細胞中提取重組的木聚糖酶用來酶活分析。木聚糖酶的活性分析是用 Lever 法，以樺木木聚糖為底物測定的。終體積為 0.03 ml 的標準的反應混合液包括：120 mmol/L 的通用緩沖液（pH 6.5)[19]、0.5% ( m/V ) 木聚糖、還原酶。反應混合液在 60°C 放置 20 min。
1 ) 細胞裂解和酶的提取
( 1 ) 將鑒定為陽性轉化株的在 2 ml 含有 100 μg/ml 氨芐和 IPTG 的 LB 中過夜培養。
( 2 ) 取出 1.5 ml 的過夜培養的 LB，11000 g 離心 30s，去掉上清液。
( 3 ) 通過振蕩懸浮上述細胞，然后加入 150 μl 的 BPER II 溶液。
( 4 ) 振蕩混勻 1 min，裂解細胞，11000 g 離心 1 min，去掉細胞碎片。
( 5 ) 將上清液轉移到新的管中，然后在 4℃ 儲存。
2 ) 木聚糖酶活性試驗
( 1 ) 在 0.2 ml PCR 管中，將 5 μl 適當稀釋的酶提取液加入到樺木木聚糖底物溶液中至終體積為 50 μl。
( 2 ) 將 PCR 管放在頂部能夠加熱的 PCR 儀中，在合適的溫度下溫育 10?30 min。
( 3 ) 將 PCR 管放在冰水中，加入 PAHBAH 儲液 100 μl 終止酶活反應，混勻。
( 4 ) 將上述混合液在 PCR 儀中 99°C 加熱 5 min 進行變色反應。確保可加熱的蓋子置于關閉的位置。然后立即冷卻到 4°C，以停止顏色的變化。
( 5 ) 將管中的溶液混勻，然后轉移 100 μl 到平底的微孔板中。用具有合適的可讀板的光譜儀檢測在 A420 nm 的吸收值。