生物磁分離在免疫化學發光（CLIA） IVD試劑盒研發生產時的5個關鍵性誤區
化學發光免疫分析(Chemiluminescent immunoassay,CLIA)將高靈敏的化學發光技術與高特異性的免疫反應結合起來，建立了化學發光免疫分析法。CLIA具有靈敏度高、特異性強、線性范圍寬、操作簡便、使用成本低等特點。CLIA應用范圍較廣，既可檢測不同分子大小的抗原、半抗原和抗體，又可用于核酸探針的檢測。由于其優勢，基于這一技術體外診斷測試的數量與日俱增。而每當一個化學發光分析儀安裝在醫院或診斷實驗室后，其對應試劑盒的需求將可能達到一天數千套的用量。
因此，CLIA IVD試劑盒的需求量已開始飆升，但早期的小規模生產、純人工操作和簡略的質量控制手段已經無法應付大規模生產的需要。如何確保批次間的一致性；如何確保放大生產規模后質量的穩定性；如何確保成品最終應用的有效性（最終在分析儀中只使用不超過幾百微升）都成CLIA IVD試劑盒生產的關鍵。在超過十年的發展階段，我們發現了五個在生物磁性分離過程中的關鍵誤區。這些誤區容易被忽略但常常延誤項目進度，造成重大的經濟損失，有時甚至會使生產陷入風險。因此正確掌握磁性分離的技術信息是保證產品研發和生產成功的關鍵。
圖1：新型生物磁分離系統
如何描述一個生物磁分離過程？
當一個新的CLIA-IVD試劑盒從研發階段轉移到生產階段時，所有的生產操作參數都需要重新調整以適應新的產量和處理體積。生物標志物的規格，緩沖液和包被的操作都得益于非磁性試劑盒生產時所積累的經驗。抗體與磁珠的偶聯珠與膠體金或乳膠粒子很相似，但清洗環節的操作使用磁性分離這一方法與其他非CLIA-IVD試劑盒生產有很大區別。
雖然CLIA試劑盒在生產的分離階段使用生物磁分離似乎是顯而易見的選擇，但在實踐的過程中仍存在著一些問題。第一個是描述整個流程本身，當和IVD試劑盒制造企業溝通時發現在生物磁分離方面，他們經常提到如下幾方面：
分離時間：從緩沖體系中分離固相的時間。
磁珠損耗：生產過程中丟失的磁珠（和偶聯的生物標志物）的最大值。
批次處理體積：所需處理的批次大小，甚至一些情況下處理體積有彈性。
要避免不可逆的聚集: 在生產的過程中如發生不可逆的磁珠聚集需要采取多種方式使之重新懸浮，懸浮后必須檢查是否處理得當。因為每一個試劑盒（毫升級別）都需要相同的性質，不正確的重懸浮處理會增大批次間的差異。
但是，以上這些都是“功能性”的參數，他們是磁性分離的結果而非影響分離過程的因素。在整個生物磁性分離的過程中，真正缺失但定義了整個分離過程的參數是什么呢？
在生物磁分離過程的關鍵參數是磁力。磁珠以特定的速度移動，這是由于磁力和阻力之間的競爭而產生的凈力，后者是由緩沖液粘度引起的。
誤區1：總歸咎于磁珠不好
在選擇磁珠是，用戶很關心是否選擇了“正確”的磁珠。假設已經選擇好了合適的生物標志物和完美的耦聯/包被方式，那么接下來用戶選擇“正確”的磁珠就應該具有如下一些特征：
1）高回收率/快速分離，匹配在分析設備中的時間，磁性分離速度足夠快，在大規模生產過程中沒有大量磁珠和耦合的生物標志物損失？
2）無聚集問題，磁珠可被輕松的重混懸浮。即使磁珠聚集可以通過幾個額外的超聲處理步驟進行處理就可恢復？（但這在大體積生產過程中難以控制和操作）
3）低批次間差異，每一批等分（通常小于毫升）和生產批次（升級別）必須一致。如果沒有，差異會影響分析器給出的結果？
如果以上要求沒有達到會如何？
對有缺陷的磁力分離結果，試劑盒生產企業最普遍的反應是磁珠的選擇是“錯誤”的。然后生產企業聯系磁珠供應商（或替代供應商）關于磁珠進行長期討論，重審包被方法等，如果一旦陷入這個階段，新產品的研發和推出將被嚴重影響，進度將大大延后。
提示：如果生物標記物能很好的耦聯在磁珠上，遇到問題就更換磁珠將是一個昂貴而又耗時的做法，同時問題仍然也得不到有效的解決!
生產企業應擺脫對“正確”和“錯誤”磁珠的糾結，而把重點關注放在對生物磁性分離設備和設備上。通過對比下圖，我們可以發現同樣懸浮的磁珠在不同生物磁性分離器的作用下會表現出完全不同的情況。
圖2：采用兩種磁鐵分離相同的磁珠懸浮液
圖2顯示左邊的傳統磁力架（藍色）處理的磁珠緩慢分離開。這意味著更長的時間才能完成分離或承受更高磁珠和生物標記物的損失。然而，如果等待較長的分離時間以避免損失，一些磁珠將受到不可逆的聚集問題的影響，因為先分離的磁珠（最接近瓶壁的位置）受到非常強的磁力將磁珠擠壓在一起。如果在這一分離步驟，我們不考慮分離設備的影響，只從磁珠分離的表現來進行判斷，那么我們將得到一個錯誤的結論：我們必須更換其它磁珠來解決問題。同時，從圖2我們可以觀察到，相同的磁珠懸浮液通過先進生物磁性分離設備（右邊橙色）的結果我們可以看到分離情況卻是完全不同的。磁珠在相同的速度下快速得到分離，同時由于均勻磁力，貼壁磁珠在更短的時間內受到溫和磁力的作用，消除了不可逆的聚集風險。
給CLIA-IVD試劑盒生產商的建議：
與其不斷考慮更換磁珠，我們更應該更快捷、更經濟地去挖掘出來源于磁性分離設備的問題和因素。當調整了磁性分離設備后，如果磁珠能正常懸浮，那么對磁珠的疑慮也就不攻自破了，同時也沒有必要再重建包被的操作工藝。
誤區2：選用更大的磁鐵來避免分離的損耗
在上一部分我們討論了為什么在分離時一遇到問題就歸咎于磁珠是一個很大的誤區，在分離過程中引起問題的最主要原因是產生磁力的磁鐵而非磁珠。但只光知道應調整磁力而不知如何正確選擇磁鐵也無法解決上述問題。
第二個常見的誤區是假設增大磁鐵就會增強磁力。然而，磁力并不依賴于磁場，而是依賴于磁場梯度。如果磁鐵較小，磁場變得均勻，磁力大大削弱，其結果是：分離時間過長或更高的原料損耗。如果磁鐵較大，磁場和磁場梯度隨著距離的衰減很快，磁力不足以吸引距離最遠的磁珠。更糟糕的是接近磁鐵的磁力太大，造成不可逆的磁珠聚集。
在使用了相同數量的永磁鐵前提下，通過下圖比較大型普通磁鐵和先進生物磁分離系統。最佳的磁力范圍是保證磁珠能快速分離和降低損失，同時對于貼壁的磁珠提供一個溫和的保留力，保證磁珠吸附在容器壁的同時不會引起不可逆的聚集。在下圖左邊所示，青色部分表示最佳磁力的區域。懸浮在最佳分離條件下的磁珠只是這批磁珠的一小部分。在磁鐵附近磁力迅速增加，因此磁珠不可逆聚集的風險變高。長時間的分離過程更加劇了這種風險。相比之下，先進的生物磁分離系統通過調整磁場分布產生均勻的磁力。這意味著整個工作區域中的磁力是相同的。相比普通磁鐵，在遠離容器壁的磁珠受到更強的磁力。磁珠的移動速度更快，減少了分離時間，保證了磁珠和偶聯生物標志物的完全回收。在貼壁保留區，磁力仍然相同，溫和的磁力保證磁珠能帖附在保留區的同時不會產生不可逆的聚集。
圖3：磁力分布圖，傳統磁鐵（左），先進從生物磁分離系統（右）
提示：傳統永磁鐵只能產生一個非常低的磁場梯度，通常離磁鐵只有幾毫米舉距離，而遠離磁力非常低。這意味著磁珠和蛋白/生物標志物的大量損失。即使分離操作很長的時間，磁珠也幾乎無法完全分離。
所以，如何避免誤區2：選用更大的磁鐵來避免分離的損耗？我們應該用磁力而不是磁場來衡量分離系統，同時磁力需要正確地平衡，因為過強的磁力量會導致不可逆的聚集問題。最理想的磁性分離系統可為最遠的區域和保留區（貼壁區）同時提供擇合適的磁力。
誤區3：純粹地通過分離時間來定義整個分離過程
第三個常見誤區涉及分離過程的驗證。
很多情況下，生物磁分離過程往往是通過一個指定的分離時間來進行驗證。這種驗證方法的問題在于驗證與特定的磁場輪廓和容器大小相關聯，而且分離時間僅僅是速度（與磁力成正比）和磁珠所運動距離的結果，分離時間并不能用來描述磁珠分離的過程條件。
為了更好的驗證分離過程，我們需要額外的信息來描述這一分離過程。一種方法是光學監測懸浮液通透性的變化過程（在分離起始階段懸浮液是渾濁的，磁珠一旦開始分離，液相就會趨于通透）。這樣，驗證可以不僅在結束階段（分離時間），而在整個生物分離的過程中，容器內的變化都可被觀察和記錄。
圖4：磁性分離懸浮液的渾濁度對比，起始階段（左），結束階段（右）
如果生物磁分離系統具有良好定義的條件（即均勻磁力），不透明度隨時間變化的曲線通常會形成S形。定義該曲線的兩參數指數P與時間t50分別反映曲線的陡度和分離時間達到一半時最大和最小的不透明度之間的差異。這兩個參數取決于一些源于磁珠的特性（直徑、磁性含量%、磁性材料）和懸浮液（緩沖液粘度、磁珠濃度等）。由于測量曲線的形狀受所有這些參數的影響，因此監測可以為不同的分離過程建立特定的參考數據和曲線。當固定了磁力條件后，同類的分離過程的驗證就應遵循相對應的參考曲線。
當整個過程可被監控而不僅是單獨通過分離時間來判斷時，過程中的質量問題可更快地被發現。通過對比與參考曲線的偏差可以揭示眾多生物磁性分離過程中的生產問題（聚集、不正確的磁珠特征和磁珠濃度等）。這意味著生產人員可更早采取糾正措施，從而降低成本。
圖5：建立一個生物磁分離工藝和光學監測所得的典型形分離曲線（S型）
那么，怎樣才能避免誤區3：純粹地通過分離時間來定義整個分離過程？通過使用均勻的磁力，所有的磁珠都是在相同的條件下進行分離并監控過程。通過實時監控，除了減少試劑盒批次間的差異外，這些步驟還改進了過程的質量控制，有助于及時發現生產問題。
誤區4：輕視過程的可放大性
當開發一個化學發光試劑盒，生產商最初的重點往往是在生物標志物如偶聯到磁珠上。而生物磁分離條件通常會被忽略。在研發的早期階段，分離過程通常是利用普通的磁力架進行小規模的開發。當產能在放大過程中如果分離條件沒有很好地明確，研發階段磁珠所受磁力與放大后的新系統完全不同，這一問題是導致磁珠和原料損耗以及磁珠不可逆聚集問題發生的重要因素。這需要一個昂貴且費時的再工程過程來解決這些問題，以得到一個原料損失和磁珠聚集水平低到足以提供一個具有經濟效益和高效率的生產方案。
圖6. 小尺寸（左）和大尺寸（右）非均勻磁分離架上磁性分離和換液示意圖，黑色虛線表示磁力的大小，靠近磁鐵部分磁力大，遠端減小
在小規模分離操作中，小范圍很容易產生高磁場梯度。即使并非所有磁珠都是磁飽和的，由于磁珠運動距離短，分離時間也很短并不會引起太大的損失或不可逆聚集。但大規模分離中，由于非均勻磁力作用將會引起更大的損失（更大距離和較低的磁力）和成倍增長的分離時間。在大尺寸容器內，靠近磁鐵的磁力更大，將會增加不可逆轉聚集的風險。而遠離磁鐵的部分由于受到磁力微弱導致分離時間變長。與此相反，均勻的磁性分離條件就避免了這些問題，會時生產更容易放大。當使用均勻梯度磁場，即使尺寸變大，磁力也可以保持不變。
為避免放大對磁性分離帶來的影響，放大分離過程中直接復制原有參數，避免磁珠的損失和避免不可逆磁珠聚集尤其重要，生產企業可在初期研發期就采用提供穩定磁力和可放大的分離器設備研發。正如SEPMAG?系統可提供穩定的磁力和便利的放大支持，從初始小體積研發期就可確定明確的工藝條件，研發期后到放大生產，使生產企業無需重新調整工藝（如圖7所示），大大縮短了從研發到生產以及后續放大所需的時間和資源。
圖7. 先進生物磁分離器可提供均勻磁場支持不同尺寸的放大
誤區5：磁場操作條件未采取合適的安全措施
上述4點都與生產過程有關，然而，即使得到一個完美的可重復性，高效的生產過程， IVD制造企業的生產中隱藏的對操作者和設備的安全風險也是必須極力避免的。
規模的應用磁鐵會產生高風險事故。磁鐵吸引鐵磁性物體，包括其他的磁鐵、剪刀、螺絲刀或其它磁性物體。潛在危險發生在當身體或設備暴露在磁鐵和被吸引物之間，而當磁鐵體積越大，對使用者的風險也就越大。對于有植入起搏器或者其他植入類設備的人來說，風險同樣較高：磁場會干擾設備導致故障。這也是在醫院的MRI區域附近會張貼嚴重的危險信號標志的原因。
安全風險不僅對使用者存在傷害風險，實驗室設備也同樣有受到磁場的影響的風險，尤其是包括磁記錄介質在內的物品，比如信用卡和/或公司磁卡。計算機、手機和硬盤驅動器也可能丟失信息，許多實驗室的電子設備也會受到影響。
根據磁場范圍設定安全操作區域。清理出危險區域（磁場> 3mT，30高斯）,這一范圍內隱藏由磁鐵和磁性物體之間的吸引力引發的機械事故風險。另外還需要清理出更大的警戒區域（磁場> 0.5mT或5高斯），因為它有消除磁記錄介質和干擾起搏器類植入器械故障的風險。
圖8：操作安全區域設置，傳統磁鐵（左），先進生物磁性分離器（右），危險區（橙色），警戒區（灰色）
這些安全設置非常重要，如圖8顯示，如果磁分離架的設計并沒考慮特殊磁安全處理，雜散磁場將意味著計算機和其他電子設備可能暴露在危險區。因此在危險區中，足夠大的空間應該被清理出并避免放置其他設備。如果需要在同一個房間里放幾個磁力分離裝置，問題就會變得更加嚴重。相反，如果生物磁分離系統的設計降低雜散磁場，則磁分離系統將對外界的影響將大大降低，同時減小面積的需求。如圖8所示，幾臺先進生物磁分離系統放置所需要的面積小于所需的一個傳統的磁分離架面積。
因此，如何解決誤區5：磁場操作條件未采取合適的安全措施？首先，應制定安全操作規范和計算安全操作范圍：設置警戒區域和危險區域。其次，除了考慮磁分離器/架的分離性能外，還應注意磁分離器/架產生的雜散磁場。盡可能選擇雜散磁場小的生物磁分離系統或安全的磁性分離設備。例如SEPMAG?先進的磁性分離系統通過特殊的設計可以放置在電腦旁使用并且保護操作者遠離使用傳統大型磁鐵可能帶來的危險。這樣可以減少事故風險，同時減少危險區域也為其他設備留出更多放置空間。
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