摘 要：隨著生物分子光學標記技術的不斷進步，光學技術在揭示生命活動基本規律的研究中正發揮越來越重要的作用，也為醫學診斷與治療提供了更多、更有效的手段。本報告首先簡要介紹光學技術在生物醫學應用中的發展概況，然后從基因表達及蛋白質—蛋白質相互作用研究方面，討論生物分子光學技術的特點與優勢，闡明基于分子光學標記的光學成像技術是重要的實時在體監測手段，最后討論光學成像技術在組織功能/腦功能成像中的應用原理與現狀。
關鍵詞：光學技術、生物醫學、醫學診斷與治療、分子光子學、醫學成像
一、生物醫學光學發展概況
生物醫學光學（Biomedical Optics）是近年來受到國際光學界和生物醫學界廣泛關注的研究熱點，在生物活檢（使用光學相干弱層析成像技術——OCT）、光動力治療（PDT）、細胞結構與功能檢測（運用激光共焦掃描顯微鏡）、基因表達規律的在體觀測（運用熒光基因標記技術）等問題上取得了可喜研究成果，目前正在從宏觀到微觀多層面上對大腦活動與功能進行研究。Science在最近幾年已發表相關論文近20篇。隨著光學技術的發展，生物醫學光學將在多層次上對研究生物體特別是人體的結構、功能和其他生命現象產生重要影響。
二、生物分子光學技術
細胞重大生命活動的發生和調節是通過生物大分子間（蛋白質—蛋白質、蛋白質—核酸等）相互作用來實現的。深入研究基因表達及蛋白質—蛋白質相互作用不僅能揭示生命活動的基本規律，同時也能深入了解疾病發生的分子機制，進而為尋找更有效的藥物分子、提高藥物篩選和藥物設計的效率提供新的思路。
（一）現代分子生物學在研究基因表達和蛋白質—蛋白質相互作用中的局限性
現代分子生物學技術的迅速發展，特別是隨著后基因組時代的到來，人們已經能夠根據需要建立各種細胞和動物模型，為在體研究基因表達規律、分子間的相互作用、腫瘤細胞的增殖、細胞信號轉導、誘導分化、細胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學條件。
然而，盡管人們利用現有的分子生物學方法，已經對基因表達和蛋白質—蛋白質相互作用進行了深入、細致的研究，但仍然不能實現對蛋白質和基因活動的實時、動態監測。在細胞的生理過程中，基因、尤其是蛋白質的表達、修飾和相互作用往往發生可逆的、動態的變化。目前的分子生物學方法還不能捕獲到蛋白質和基因的這些瞬時、動態、可逆的變化，但獲取這些信息對與研究基因的表達和蛋白質—蛋白質的相互作用又至關重要。因此，發展能用于活體、動態、實時、連續監測蛋白質和基因活動的方法非常必要。
光學成像技術與分子生物學技術的結合為研究上述科學問題提供了現實與可能。因此，在現代分子生物學技術基礎上，急需發展新的成像技術。在活體動物體內，如何實現基因表達及蛋白質—蛋白質相互作用的實時在體成像監測是當前迫切需要解決的重大核心科學技術問題！這是也生物學、信息科學（光學）和基礎臨床醫學等學科共同感興趣的重大基礎問題。對這一科學問題的研究不僅有助于闡明生命活動的基本規律、認識疾病的發生發展規律，而且對創新藥物研究、藥物療效評價以及發展疾病早期診斷技術（光子醫學診斷技術）等產生重大影響。
（二）基于分子光學標記的光學成像技術是重要的實時在體監測手段
光學成像技術正成為實時在體研究分子間/分子內蛋白質—蛋白質相互作用、離子通道、細胞膜蛋白及相關信號轉導、生化底物及酶轉運等的重要手段，由于具有高時間、空間分辨率，比現有其他手段更為直接，因而可望成為后基因組時代新藥靶發現和高通量藥物篩選的新方法。
表1和表2分別給出了目前處于研究和應用階段的幾種主要成像技術的應用場合及參數比較。比較相關參數可以看出，基于分子光學標記的光學成像技術已經在活體動物體內基因表達規律方面展示了有較大的優勢。
例如，正電子發射斷層成像（PET）可實現對分子代謝的成像，空間分辨率：1-2mm，時間分辨率：分鐘量級。與PET比較，光學成像的應用場合更廣（可測量更多的參數，請參見表1），且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米。因此，二者比較，雖然光學成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數種類與時空分辨方面有一定優勢。對于小動物（如大鼠）研究來說，光學成像技術可以實現小動物整體成像和在體基因表達成像，例如，初步研究表明，熒光介導層析成像可達到近10cm的測量深度（Nature Reviews 2002）；基于多光子激發的顯微成像技術可望實現小鼠體內基因表達的實時在體成像（Nature Medicine 2001）。
表1 主要成像技術及應用場合（Nature Reviews 2002）
成像方法
主要應用場合
磁共振成像（MRI）
高對比度，用于表型、生理成像和細胞跟蹤的最好的全方位成像系統。
計算機層析成像（CT）
肺和骨癌成像
超聲成像
血管和介入成像
正電子發射斷層成像PET
分子代謝，如葡萄糖，胸腺嘧啶核苷等的成像
單光子發射斷層成像SPECT
探針，如抗體，肽等的成像
熒光反射成像FRI
表面腫瘤分子事件的快速成像
熒光介導層析成像FMT
對深部腫瘤靶向標記或“靈活的”熒光染料標記進行定量成像
生物發光成像BLI
基因表達，細胞追蹤成像
活體顯微成像
以更高分辨率實現上述所有參數成像，但測量深度和范圍有限。
雖然在體光學成像技術在時/空分辨、實時、動態和多參數測量等方面有一定的優勢，但仍然有大量的技術問題需要研究。例如，從光學標記角度看，如何針對所要研究的體系和對象，為實現在活細胞和動物體內監測基因表達及蛋白質—蛋白質的相互作用，發展特異性更高、更易于光學測量的核酸和蛋白質探針，是當前要解決的關鍵技術問題之一。
表2 常用成像技術及參數比較（Nature Reviews 2002）
成像方法
空間分辨率
時間分辨率
測量深度
造影劑
價格
MRI
10-100?m
Min/hrs
無限制
釓，鏑和氧化鐵離子
$$$
CT
50?m
Min
無限制
碘
$$
超聲
50?m
Min
mm
微型氣泡
$$
PET
1-2mm
Min
無限制
18F，11C，15O
$$$
SPECT
1-2mm
Min
無限制
99mTc（亞穩態锝）, 111In（銦）
$$
熒光反射成像FRI
1-2mm
Sec/min
<1cm
熒光蛋白，近紅外熒光染料
$
熒光介導層析成像FMT
1-2mm
Sec/min
<10cm
近紅外熒光染料
$$
生物發光成像BLI
幾mm
Min
cm
螢光素
$$
活體顯微成像
1?m
Sec/min
<400?m
熒光蛋白，發光蛋白，近紅外熒光染料
$$$
其中：$表示價格<10萬美元；$$表示價格在10-30萬美元之間；$$$表示價格>30萬美元
表3簡要介紹了近幾年發展十分迅速、正受學術界高度關注的幾種研究活細胞內基因表達與分子間相互作用動力學過程的光學成像技術的基本原理與特點，主要包括熒光共振能量轉移（FRET）、熒光壽命成像（FLIM）、熒光漂白后恢復（FRAP）、熒光漂白后定位（FLAP）、熒光關聯譜（FCS）和成像關聯譜（ICS）等。如何發展和整合相關的成像方法，并應用于在體成像，為基因表達和蛋白質—蛋白質相互作用研究提供更先進的手段，也應是本項目研究的關鍵技術問題。
在數據處理與可視化研究方面，也存在重大的科學問題。例如，對于600微米左右的熒光，雖然可以穿透較厚的組織而被探測到，但由于經過了多次散射，如何定位發光位置，需要根據生物組織中的光子傳輸規律，通過圖像重建算法來實現，事實上這方面的研究已經成為學術界的研究熱點。例如，基于成像測量（包括光學成像）的分子與細胞事件動力學過程的可視化研究被評為2002年Science的十大突破之一（Science, Dec.20, 2002）。
表3 活體細胞內基因表達與分子間相互作用動力學過程的實時在體光學成像技術
名稱
原理與應用
熒光共振能量轉移FRET—Fluorescence Resonance Energy Transfer
供體分子吸收一定頻率的光子后被激發到更高的電子能態，在該電子回到基態前，通過偶極子相互作用，實現了能量向鄰近的受體分子轉移。FRET可用于測量分子內部間距，或蛋白質的不同反應活性部位、模型系統中的蛋白質與脂質、或細胞表面蛋白質等分子之間的距離。即可測量分子間的接近度，距離，方位和動力學特性。由于FRET效率與供體受體間的距離成6次冪的關系，所以FRET效率對距離的變化非常靈敏，可以靈敏測量10?-100?范圍內的距離變化。
熒光壽命成像FLIM—Fluorescence Lifetime IMaging
熒光壽命成像顯微鏡和壽命測量與熒光濃度或激發強度的變化無關，FRET與FLIM的結合可提供高的空間（納米）和時間（納秒）分辨率。通過供體壽命測量和處理時間分辯圖像，可精確計算相互作用的蛋白質間的距離。由于只測量供體熒光壽命，在FRET—FLIM成像中，可不考慮光譜的交疊問題。
熒光漂白（后）恢復 FRAP—Fluorescence Recovery After Photobleaching
FRAP是研究蛋白質動力學的重要工具。在FRAP實驗中，利用激光脈沖有針對性對被熒光蛋白標記的細胞內的一個小區域快速、不可逆地漂白。該漂白區域完全沒有熒光信號。然后使用延遲顯微鏡測量熒光信號隨時間的恢復情況。熒光的恢復是由未漂白的分子流入被漂白區域所造成的。因此熒光信號恢復的動力學過程含有了被標記蛋白的表觀遷移信息。
熒光漂白（后）定位 FLAP—Fluorescence Localization After Photobleaching
FLAP是在活細胞內對特定分子的光學標記進行定位和跟蹤的新方法。被定位的分子包括兩個熒光基團：一個被漂白，另一個則作為參考標記。與熒光漂白后恢復（FRAP）和熒光漂白中的損耗（FLIP）技術不同，利用參考熒光基團，通過簡單的圖像差異，即可跟蹤光學標記分子自身的分布。因此，FLAP實際上可與光敏化方法相對比。與籠鎖熒光探針方法相比，其主要優點是可用于跟蹤細胞直接表達的嵌合熒光蛋白。
熒光關聯譜 FCS?—Fluorescence Correlation Spectroscopy
FCS可用于分析小規模分子集合輻射行為所引起的微小的自發擾動，從而反映分子內與分子間的動力學過程。由于FCS可觀察納摩爾（nanomolar）范圍的熒光分子，因而可在大的空間與時間范圍內，非常近似地模仿不同過程中的實際生理條件，如結合與離解反應，生化底物的轉運、酶的周轉，分子內（如結構）的動力學過程等。FCS的時間分辨率也可以達到納秒（ns）量級。
成像關聯譜 ICS—Imaging Correlation Spectroscopy
ICS為測量活細胞表面分子內相互作用的動力學過程提供了一種新的方法，還可以幫助闡明細胞膜上蛋白質的聯合是如何激活信號轉導通道的。ICS可測量分布在細胞表面的單個分子的密度、分子群、有組織的結構或功能區。該技術可探測單個分子的空間分辨率約為200平方微米。由于與分子的總數目有關，因此可用于估計單分子實體（molecular entity）中的平均分子數目。
國際同行對動物活體內基因表達與蛋白質—蛋白質相互作用的在體光學成像研究也非常重視。例如，美國NIH已經召開過三次研討會，認為新的在體生物光子學方法可用于癌癥和其它疾病的早期檢測、診斷和治療。新一代的在體光學成像技術正處在從實驗室轉向癌癥臨床應用的重要時刻。在NIH的支持下，NCI（美國國家癌癥研究所）正在計劃5年投資1800萬美元，招標建立“在體光學成像和/或光譜技術轉化研究網絡（NTROI）”，其研究內容主要包括：光學成像對比度的產生機理、在體光學成像技術與方法、臨床監測、新光學成像方法的驗證、系統研制與集成等五個方面。美國NIH于2000年底成立了的國家生物醫學影像與生物工程研究所（NIBIB）,在其首批支持的項目中，光學成像方法約占30%。2000年7月，美國NIH投資2000萬美元，開展小動物成像方法項目（SAIRPs）研究，受到生命科學界的高度關注，其中光學成像方法也是其中的研究重點之一。NSF 在2000-2002年發布了四次Biophotonics Partnership Initiative 招標指南，呼吁開展多學科的合作研究。
（三）研究熱點與發展趨勢
從前面的討論中可以看出，研究熱點與發展趨勢應包括如下三個方面：
1. 生物分子的光學標記新技術研究。針對所研究的體系和對象，發展具有高度特異性的、可用于生物體內活體成像的核酸和蛋白質探針。例如研制新的發光蛋白用于動物模型體內，實現蛋白質在動物體內的表達成像研究；設計并合成新型的具有高特異性的核酸探針，實現基因轉錄調控的活體監測；發展在活體細胞內監測蛋白質—蛋白質的相互作用的新方法；發展新的表面修飾和標記方法，將熒光納米顆粒作為探針，用于活體細胞和動物器官的基因表達和蛋白質—蛋白質實時在體光學成像研究。
2. 在體光學成像新技術與應用研究。針對不同的研究對象和應用目標，發展各種新型的在體光學成像技術。例如實現小動物體內深部目標探測的擴散光學成像方法；實現動物體內藥代動力學和藥理學過程的實時在體成像監測的相干域光學成像方法；實現對動物體內基因表達和分子間相互作用過程在體成像監測的多光子熒光等非線性光學成像方法；實現不同層次多參數測量的集成化在體光學成像系統；以及無須外源性標記的各類在體功能成像方法等。應用研究包括：a) 以小動物為研究對象，在動物體內不同部位（如肺、肝、腦等）的腫瘤模型或其它疾病模型基礎上，研究在體基因表達規律，監測腫瘤發生發展的動力學過程；對活體動物體內分子與細胞事件進行定量成像研究，例如通過熒光標記蛋白的互補與重組策略，結合生物發光光學成像技術，可以實現對活體內蛋白質—蛋白質相互作用的定量無損成像，從而有望提供一種有潛在價值的工具，對研究處于自然在體狀態環境下的細胞內的蛋白質—蛋白質相互作用、對以調節蛋白質相互作用為靶標的新藥的在體評估都具有非常重要的意義。動物組織、器官到整體水平的在體光學成像可望為研究藥物作用靶點和評價藥物作用效果提供重要技術手段。b) 以小動物體內的活細胞為研究對象，用光學成像技術，實時在體研究細胞內基因表達與分子間相互作用的動力學過程。例如，可文中提到的FRET、FLIM、FRAP、FLAP等技術研究蛋白質分子間的相互作用、計算蛋白質間的作用距離、特定分子在細胞內移動、定位與跟蹤，以及蛋白質的構像變化等；運用FCS技術，在較大的空間與時間范圍內，研究不同分子的結合與離解反應，生化底物的轉運、酶的周轉，以及分子內（如結構）變化的動力學過程等；運用ICS技術研究活細胞表面分子內相互作用的動力學過程，研究細胞膜蛋白的聯合及其與信號轉導通道的激活關系等。
3. 數據處理、圖像重建與可視化方法研究。在光學成像檢測的基礎上，還需要開展數據處理、圖像重建與可視化方法研究。主要是根據光子傳輸規律和光學檢測模式，對所獲得的數據進行處理和可視化研究。
三、醫學光學成像技術
醫學光學成像技術從理論上可分為擴散光學成像與相干域光學成像，前者成像深度較深，理論基礎是光子輸運方程的擴散近似，被檢測的光學信號會在組織體內經歷多次散射，如何建立散射信息與組織光學特性參數變化間的關系和提取散射信息是其關鍵；后者成像深度主要在組織淺層，散射影響較小，如何避免散射和在強散射背景中提取有用的結構與功能信息是其關鍵。
四、結論
生物醫學光學是新興交叉學科。光學技術為揭示生命活動的基本規律、臨床醫學診斷與治療提供了新的技術手段和方法，同時，生命科學的發展，也不斷對光學技術提出新的要求，促進了光學技術的發展。
