天然的整合膜蛋白的量并不充足。因此對其的結構測定和功能分析需要:①重組膜蛋白的生產系統;②能分離得到有活性的膜蛋白（而不是沒有功能、折疊錯誤的膜蛋白）的純化策略。表達并純化原核和真核的膜蛋白在文獻中都有報道。讀者可以參考如Grisshammer 和Tate(1995;2003) 及Grisshammer和Buchanan(2006) 的文獻，也可以查詢本書的第35章。GPCR作為真核生物的整合膜蛋白，參與細胞間的交流和感覺信號轉導[見Gether和Kobilka(l998)]。本章是對GPCR 的專題討論。
對于如GPCR 的整合膜蛋白，本章不涉及其表達的所有可能策略細節，但是這里總結了一些關鍵點。①目前還沒有一個通用的可高效表達功能受體的策略。一些GPCR能高水平的積聚在細胞膜上，而其他某些相關的受體卻很難檢測到。而且雖然推測具有相似性，但在特定的表達宿主中的不同的 GPCR表現卻十分不同。所以GPCR 的重組表達仍然是一個反復實驗的過程。例如，在表達對比研究中，已經完成的嘗試包括使用甲醇營養型畢赤酵母(Andreetal.,2006)、桿狀病毒昆蟲細胞系統(Akermounetal_，2005) 和西門利克森林病毒系統（Hassaineetal.,2006)等。目前已經有了GPCR 在常用表達宿主表達的研究總結(Sarranmegnaetal.,2003)。②通常真核宿主似乎能夠比原核宿主更好的表達有功能的、嵌膜的 GPCR(Grisshammer，2006)。但有一些例外。例如，已經在大腸桿菌中成功表達了神經降壓素受體 NTSl(Grisshammeretal.,1993;Whiteetal.，2004)、M1蕈毒堿乙酰膽堿受體（HulmeandCurtis,1988)、腺苷A2a受體（WeiBandGrisshammer，2002) 和大麻素CB2受體632(Calandraetal.,1997;Yeliseevetal.，2005)。③已經有了很多關于重組表達整合膜蛋白的描述性報道。然而，目前只有少數文獻[見 Bonander 等 (2005;2009),Griffith等（2003);Wagner等（2006;2007)]討論了特定宿主細胞對于膜蛋白過表達的反應機制。
純化受體從概念上可以分成兩步: 第一步用合適的去污劑將受體從膜中提取出來 (增溶）; 第二步使用如常規的親和標簽、與該受體特異結合的配體層析柱、分子排阻色譜和其他方法純化受體。最重要的是，必須注意選擇實驗條件以保持膜蛋白在整個純化過程中處于活性狀態。這一點怎么強調也不過分，因為很多 GPCR—旦被去污劑從質膜中提取出來就會變得不穩定。
提取嵌膜受體需要使用去污劑(詳見第34章）。去污劑的正確選擇對于長時間維持溶解受體的活性狀態非常關鍵。]V-十二烷基子1>麥芽苷（iV-Dodecyl-^^maltoside，DDM) 是溫和的非離子型去污劑，通常用于 GPCR 的增溶。添加脂樣的膽留醇半琥珀酸酯 (CholesteryIhemisuccimte) 可以提高受體的穩定性。短鏈的去污劑通常要比長鏈去污劑作用猛烈，但只要它們不損害要研究的GPCR 的完整性, 也是可以接受的。
溶解的受體必須被看成是去污劑-脂質-受體的復合物，而不是單純的受體蛋白質。
這意味著溶解后的受體的生化特性，如大小、形狀或等電點與單獨根據氨基酸序列計算出的結果是不一樣的。同樣，去污劑-脂質-受體的復合物不能被理所當然的當成是均質的。
因為在增溶過程中脂質與受體一樣結合去污劑，因此去污劑和膜的比例會決定受體周圍去污劑和脂質結合的量。在純化的過程中脂質和去污劑的結合量會發生改變。
增溶的過程必須優化，使其能夠在維持溶液中特定 GPCR 最穩定的同時得到最高的提取效率。通過放射性配體結合分析和總蛋白質含量測定，可以監測去污劑對加人的膜的系統變異 (systematicvariation) 效應。這需要計算實驗的 Bmax 值（nmol 功能性受體/mg 蛋白質) 并將其與純化的功能性受體的特異性結合的理論值相比較。如果沒有可用的功能性檢驗方法，則可以使用具有良好生化行為的如對稱的分子排阻層析譜作為受體完整性的指標。
因為在受體提取前可溶蛋白質已被去除，增溶之前的膜制備過程其實已經包含了一步初始的純化步驟，目的受體對污染物的比例也會因此提高。實際上在第一步純化過程中，受體也可從總細胞裂解物中而不是從溶解的細胞膜中富集。
很多GPCR 在去污劑溶液中都不是十分穩定 [除了視紫紅質 (rhodopsin)，只要其保持在非信號黑暗狀態（DeGrip，1982)]。導致不穩定的一個可能原因也許是 GPCR 結構上固有的柔性，即受體在去污劑溶液中具有多種構象, 而其中的一些構象會使蛋白質聚集。在純化過程中去除脂質也會引起不穩定。已經有很多方法用于提高 GPCR在去污劑溶液中的穩定性。例如，加入反向激動劑（inverseagonist)/抬抗劑（antagonist) 配體 (Cherezovetal.,2007；Hansonetal.,2008；Jaakolaetal.,2008；Warneetal.,2008)^使受體處于無信號失活狀態, 這通常比活性狀態更穩定 [見 Kobilka 和 DeUpi(2007)], 如膽甾醇半號 50 酸酯（cholesterylhemisuccinate) 的脂質或脂樣物質 (Jaakolaetal.,2008;”TuckerandGrisshammer,1996;WeiBandGrisshammer,2002) 和甘油（TuckerandGrisshammer，1996) 在純化中會提高受體的穩定性。定點突變也已經用于產生穩定性更高的GPCR(Magnanietal.,2008；Rothetal.,2008；Sarkaretal.,2008；Serrano-Vegaetal.,2008;Shibataetal.,2009), 因而能耐受更大范圍的去污劑。
去污劑溶液中 GPCR的生化和藥理性質可以粗略地分為兩類。①由放射性配體結合分析和 G 蛋白核苷酸交換實驗 (Whiteetal.,2007) 評價，在優化的緩沖條件下, 能夠純化到活性形式的均質受體被稱為功能性受體。②在某些情況下（Kobilka，1995;Whiteetal.，2004)，存在去污劑可溶的卻不能結合特異性配體的受體種類。筆者把后一種稱為非功能性的、未正確折疊 (至少在受體識別方面) 但仍是去污劑可溶的受體種類。
重組克隆技術使得在給定受體的 N 端或 C 端引入常用的親和標簽變得容易。例如，受體 N 端的 Flag 表位標簽可用于 Ml 抗體親和層析柱 (Kobilka,1995) 或受體 C 端的多聚組氨酸尾用于固定金屬親和層析（immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)(GrisshammerandTucker,1997；Hansonetal.,2008；HulmeandCurtis,1998；Jaakolaetal.,2008；Klaassenetal.,1999；Kobilka,1995；Warneetal.,2003；WeiBandGrisshammer，2002;Yeliseevetal.,2005)。一種識別牛視紫紅質 C 端的抗體層析柱（104311-tibody;MoldayandMacKenzie,1983) 可用于一步純化視紫紅質（Oprianetal.,1987;ReevesetaL，1”9) 和 C 端融合了 1D4 表位標簽的少腎上腺素能受體 (Chelikanietal.，2006)。
親和標簽的準確位置 (如遠離受體的跨膜核心或接近跨膜螺旋) 決定了受體和親和樹脂的結合步驟應該采用批量混合 (inbatch) 或采用柱上 (incolumn) 方式。太接近跨膜核心的親和標簽也許會部分地被受體蛋白周圍的去污劑層遮蔽，因此不易接近親和樹脂。
這種情況下長時間混合加載會更有效地捕獲受體 (WeiBandGrisshammer,2002)。而親和標簽暴露良好的受體可直接加載到樹脂填充的層析柱上，較短的暴露時間就能使純化標簽與親和樹脂結合。批量混合純化步驟必須手動操作，而層析柱加載可以自動操作 (WhiteetaL，2004)。雖然與蛋白質結合的去污劑的準確含量依賴于各去污劑的性質，但作為一般的指導原則，低臨界膠束濃度的去污劑比高臨界膠束濃度的去污劑在膜蛋白周圍形成更大的去污劑層 [見Bamber等 (2006)]。因此, 與高臨界膠束濃度的去污劑相比，低臨界膠束濃度去污劑會降低親和標簽與樹脂的可接近性。
許多實驗室使用 IMAC 作為第一步富集步驟。商品化的樹脂類型有 Ni2-NTA 樹脂（Ni2+-nitrilotriacetate,Qiagen)、Talon 樹脂（Co2+-carboxymethylaspartate，Clontech)和 IDA 樹脂 (iminodiacetate，Zn2+,Ni2+，Co2、GEHealthcare)。然而，不同 IMAC 樹脂的性質稍有不同 (WeiBandGrisshammer,2002)。例如, 與 Talon 樹脂相比，Ni2+-NTA 樹脂不僅能更強的結合目標膜蛋白，也會結合更多的污染物。受體的表達水平 (如目標受體和雜質的比例) 決定了第一步純化的效率。表達量越高, 第一步純化效率越高。用一步 IMAC 純化突變的/V 腎上腺素能受體能夠達到大于 90% 的純度（HansonetaL,2008)。
某些情況下，IMAC 樹脂結合去污劑增溶受體的能力低于與可溶蛋白質結合的能力 (WeifiandGrisshammer，2002;Whiteetal.，2004)。
純化的時間和步驟都應該保持到最小值，因為純化的所有階段都會引起蛋白質的損失。
