用一般的親和標簽富集受體之后，可能需要第二步純化以分離到純凈、有功能的受體蛋白。這主要是因為：①第一步純化得到的受體還不夠純, 仍有其他污染物。例如，用 XAaxanthineamineC0ngener，拮抗劑）層析柱純化腺苷受體可去除其中的一個主要污染物 (WeiBandGriSshammer，2002)。類似的, 用 NT[神經降壓肽 (neurotensin)，激動劑] 層析柱 (Whiteetal.，2004) 純化神經降壓肽受體 NTS1 可得到均一物質; 用阿普洛爾 (alprenolol，非選擇性, 腎上腺素能受體抬抗劑) 瓊脂糖層析柱純化，腎上腺素能受體。從一般親和樹脂上洗脫的受體可能包含功能性的和非功能性、錯誤折疊的受體，而后續受體_特異配體親和層析也能去除非功能性的受體部分。②一個 (或兩個連續的) 一般親和標簽步驟能得到幾乎純凈的受體，然而卻是功能性和非功能性受體的混合物。一般親和標簽不能從錯誤折疊但仍是去污劑可溶的受體中分辨出正確折疊的受體。受體的錯誤折疊可能發生在表達宿主中，也會因在去污劑溶液中不穩定而發生。受體-特異配體親和層析柱能夠從錯誤折疊的受體中分辨出有功能的受體。例如，阿普洛爾層析柱可被用于分離有功能的體-腎上腺素能受體 (Kobilka，1995)。③在粗溶的受體中加入生物素化的肽配體 (PACAP38) 及親和素樹脂，一步純化方案能夠制備高度富集的垂體腺苷酸環化酶促多膚 (pituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptide，PACAP)。
去污劑增溶的、有功能的受體含量可以通過放射配體結合 (radioligand-binding) 實驗確定。理想狀態下，放射配體應以較高的親和力結合受體，并表現緩慢的解離速率，從而在從游離配體分離出配體-受體-去污劑復合物的過程中，能夠避免非平衡狀態中導致的可能的假象 (artifact) 產生。HUlme(1990) 概述了受體結合研究。對于具有親水性而不會摻人空的去污劑膠束的標記配體，放射配體結合分析的效果最好。相反, 疏水性的配體會插入空去污劑膠團而導致非特異的高背景信號。
推薦使用氨基黑分析法 (amidoblackassay)(SchaffnerandWeissmann,1973) 檢測蛋白質的含量。在去污劑和配體存在的條件下, 許多檢測蛋白質含量的方法不準確。氨基黑分析包含一個沉淀步驟用于去除去污劑、配體或其他緩沖成分。需要注意的是，不是所有的蛋白質與染料 (如氨基黑) 有相同的結合力，這意味著如果受體與染料的結合與參比蛋白質 (BSA) 不同，則蛋白質濃度測定也許會有偏差。
從配體結合數據和蛋白質含量分析，可以計算出 Bmax 的實驗值 (nmol 功能性受體/mg 蛋白質) 并將其與純的功能受體特異結合的理論值比較。需要注意的是, 因為不同的氨基酸組成理論值對每個 GPCR 都是特異的。如果實驗值與理論 Bmax 值匹配, 則說明純化到了活性受體。
NTSl 增溶、純化和分析的更詳細的描述見 White 和 GriSShammer(2007) 的文獻，這里主要討論其要點。NTSl 融合蛋白純品的獲得可通過聯合使用 IMAC 層析柱和 NTSl 特異配體層析柱實現。
將 NTSl 與麥芽糖結合蛋白 (mahose-bindingprotem,MBP) 融合可在大腸桿菌中實現具有功能的嵌膜 NTSl 表達（Grisshammeretal.,1993)。表達質粒編碼含信號肽序列的 MBP 及其后的受體。在大腸桿菌中前導肽酶去除信號肽后，用于純化的 NTSl 融合蛋白 MBP-T43NTR-TrxA-H10(NTSl-624) 的序列組成依次為: 成熟的大腸桿菌 MBP(Lys1 到 Thr366)、N 端截斷的大鼠神經降壓素 I 型受體NTS1(T43NTR，THr43 到 Tyr424)(Tanakaetal.,I”。）、大腸桿菌硫氧還蛋白（TrxA,Ser2 到 AlallM)[TrxA 會增加融合蛋白的表達量，見 Tucker和 Grisshammerd9%)] 和 10 個組氨酸標簽（HlO)(GrisshammerandTucker，B97)。表達在低溫 (22°C) 中進行，由一個低拷貝表達質粒的弱啟動子驅動。
這避免了新生受體鏈導致的大腸桿菌轉位和膜插入機制過載的可能性。在任何給定的時間點蛋白質產量都很少，但 2 天后就能觀察到積累的正確折疊的受體。純化 10 mg 的 NTSl 融合蛋白通常需要 250 g 濕重的大腸桿菌菌體，相當于 50L 的培養規模（Whiteetal.，2004), 這很容易通過發酵實現。
在大腸桿菌中
NTSl 融合蛋白的表達量處于中等水平（即污染物和目的受體的比值高）。因此，需要一個優化的能夠有效富集受體融合蛋白的 IMAC
方案。為達到這一目的，在 Ni2-NTA 層析柱純化中，采用了 10 個組氨酸殘基的 C 端標簽而不是
6f(GrisshammerandTucker,1997)。Ni2+-NTA 樹脂和 10 組氨酸標簽受體的緊密結合允許使用含 50
mmol/L 的咪唑的嚴格洗滌步驟。這個濃度的咪唑去除了結合于 Ni2-NTA
樹脂的絕大部分大腸桿菌的污染物，但不會洗脫目的融合蛋白。這一策略不僅可以從粗制的膜中有效的純化受體，而且也能很好應用于全細胞裂解產物
(GrisshammerandTuck-er，1997)0NiB 緩沖液中的高鈉離子濃度和高咪唑濃度會減弱 NT 和 NTSl 的親和力,
從而會阻礙從 Nia-NTA 層析柱上洗脫下的功能性受體與 NT 層析柱的直接結合。因此須用緩沖液將 NaCl 和咪唑的濃度從 200
mmol/L 稀釋到 70 mmol/L，以使功能性的 NTSl 能夠結合到 NT 層析柱上。NTSl 和 NT 的結合對 NaCl
敏感，可用高濃度的 NaCl 將受體從 NT 層析柱上有效的洗脫下來(圖 36.1)。
(1) 除非另有說明，所有的步驟均在 4°C 或在冰上操作。
(2) 室溫下用錘子壓碎塑料薄板之間的 250 g 冷凍細胞。將細胞放入 Waring 攪拌器。
(3) 加人 500 mL 冷的 2X 增溶緩沖液 [100 mmol/LTris-HCKpH7.4)、60%(V/V) 甘油、4OOmmol/LNaCl]。運行攪拌器使細胞充分重懸。
(4) 將細胞懸液轉人有磁棒的燒杯中。由于攪拌器會將空氣引入懸浮液，這一步很難確定體積。因此最終的體積在第 (11) 步調節。
(5) 在攪拌的過程中，加入蛋白酶抑制劑儲備液各 ImL(PMSF,70 mg/mL 溶于乙醇; 亮抑酶肽，Img/mL 溶于水; 抑肽素 A,l.4 mg/mL 溶于甲醇)、5 mLImol/LMgCl2(終濃度為 5 mmol/L)、0.6 mLDNaseI 溶液（10 mg/mL,SigmaD-4527)和 50 mL 冷 H20。
(6) 在攪拌的過程中，滴加 100 mLCHAPS,/CHS 儲備液 [6%(w/V)(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-l-propanesulfonate)/1.2%(m/V)cholesterylhemisuccinateTrissaltinH20]。CHS 自身不溶于水，需要在 CHAPS 中溶解。
(7) 在攪拌過程中，滴加 100 mLDDM 儲備液 [10%(W/V) 水溶十二烷基-1-麥芽糖苷]。
(8) 繼續攪拌 15 min。
(9) 超聲 33 min(8s/g 細胞），1s 開，2s 關，第 4 級 (Misonix 公司超聲波破碎儀，0.5 英寸，平底探頭）。保持樣品處于冰水浴以避免超聲過程中局部加熱。這一溫和的超聲步驟能加強受體的增溶效率。
(10) 每種蛋白酶抑制劑額外各加人 ImL。
(11) 邊攪拌邊滴加冷的 H2O 至終體積 IL。
(12) 再攬拌樣品 30 min。
(13) 超速離心樣品 1 h[Beckman45Ti 轉子或同等轉子，45000r/min(235000 g 于 Fmax)]。
(14) 回收增溶后受體 (上清液中）。
(15) 邊攪拌邊滴加咪唑儲備液 (2moLL, 用 HCl 調節到 pH7.4, 終濃度 50 mmol/L)。0.22pm 濾器過濾樣品。此時可用 IMAC 層析柱和神經降壓素親和層析柱從此上清液中純化受體。
此純化可用 AktaPurifier(GEHealthcare) 層析系統的兩柱模式在冷室全自動完成，細節詳見 White 和 Grisshammer(2007)及 White 等(2004)的文獻。純化儀裝備有氣體傳感器、樣品泵 P950、改良的進樣閥、一根 100 mL 的 Ni2+-NTA 層析柱、一根 20 mL 的 NT 層析柱和分離組分收集器 Frac950。所有的純化步驟也可用更簡單的設置操作，即先用 IMAC 層析柱純化，隨后將 Ni2+-NTA 層析柱的洗脫液稀釋后再上樣加載到 NT 層析