SDS-PAGE
Laemmli(1970) 描述的 SDS-PAGE 在很長一段時間內作為各種生化分析中分辨完整蛋白質的備選方法。這主要是因為對于疏水性很強的蛋白質,SDS 是最好的增溶去污劑，所有的蛋白質，包括堿性很強的蛋白質，都向同一方向移動, 分離取決于各自的表觀分子質量 (通常稱為分子質量）。
1.分離原理
當將過量的 SDS 加入到蛋白質溶液中時，蛋白質會形成一些陰離子微粒，其每個質量單位帶一個恒定的凈負電荷。蛋白質的三級結構和二級結構被破壞，肽鏈被解開。為了使肽鏈完全展開，需要使用諸如 2_巰基乙醇或二硫蘇糖醇等還原劑把半胱氨酸之間的二硫鍵打開。Ibel 等 (1990) 認為, 這些復合物的多肽表面部分被覆蓋，部分被打開，猶如項鏈一般。在電泳過程中所有的 SDS 微粒都移向正極, 其電泳遷移率主要取決于分子質量，但也會受蛋白質疏水性的影響。如果將蛋白質的遷移距離對表觀分子質量的對數作圖，就會得到一條在線性范圍內的 S 形曲線。在共遷移的蛋白質分子質量標準的輔助下，就可以估算多肽的分子質量。
2.膠的類型
一般來講，SD&PAGE 可以在各種各樣的基礎緩沖體系中進行；但是，LaemmIi(1970) 創立的不連續緩沖體系是最常用的體系, 在膠中使用 PH8.8 的 Tris-HCl, 在電泳緩沖液使用 SDS^Tris-甘氨酸。對于一維分離，pH6.8 的低濃度積層膠使樣品緩慢進入膠內，而不發生聚集，而且在分離起始時有壓縮條帶的效果。但是, 在二維凝膠電泳中通常不使用積層膠，因為蛋白質已被預分離，而且已經在 3 mm 寬的 IPG 膠條內被高效濃縮 (詳見本章 3.6 節)。
標準的基質是含有 12.5%T(全部為丙稀酰胺) 和 2.6%C(用于交聯的雙丙烯酰胺) 的均一膠層。但一些應用中對于確定的范圍需要精確分離。例如，對于高分子質量蛋白質需要更低的％T; 而對于低分子質量蛋白質，更高的會有更好的解析度, 所以濃度要提高。梯度 SDS-聚丙烯酰胺凝膠可以提供更大動態范圍的分辨率, 但是其灌膠的一致性和可重復性是極大的挑戰，但這些要求對于使用二維凝膠的定量蛋白質組學是至關重要的。多孔梯度凝膠顯示出更寬的分子質量線性范圍, 并且可提高一些較難解析的蛋白質的分辨率, 如糖蛋白。
SDS 電泳可在夾在玻璃板中的盒式垂直裝置中運行，也可在水平平面上進行。膠的厚度為 1.5~ 0.5 min。較厚的凝膠在力學上更加穩定，但是更難染色，而且會產生額外的樣品損失，對隨后的質譜分析也會產生額外的背景噪聲。較薄的凝膠更易有效地冷卻，因此電泳可以進行得更快從而有更好的分辨率。
相對于過去幾十年中二維凝膠流程取得的進展，二維 SD&PAGE 分離幾乎沒有什么變化。垂直電泳系統的使用更普遍，同時跑 1 塊或 12 塊甚至更多塊膠的設備也已經出現。在歷史上水平平板裝置也是可行的, 而且因其低試劑消耗量 (如 SDS 電泳緩沖液）、樣品的處理方法以及較短電泳時間帶來的提高分辨率的潛力，現在有復興的跡象。一些進展包括: 使用有彈性的塑料支持物 [包括用于差異凝膠電泳 (DIGE) 和其他基于熒光的技術的弱熒光介質], 用于同時灌制多塊可重復的丙烯酰胺梯度和不同丙烯酰胺配方的凝膠的特別裝置，以增加凝膠的保質期和耐用性。
堿性 pH 梯度分辨率的提高
相對于酸性 pH 梯度, 堿性 pH 梯度的高分辨率等點聚焦更具有挑戰性，這既是由于陰極漂移的作用，又是由于維持蛋白質可溶性的還原劑的丟失（DTT 是弱酸, 在 pH 大于 8 時帶電，因此會與梯度的堿性區域分離）。陰極漂移作用最早通過引人非平衡 pH 梯度電泳 (NEpHGE) 得到解決 (OFarrelletal.,1977)。但是在 pH 大于 8 時還原劑丟失的問題仍然存在，而且由于半胱氨酸不再受到保護，導致多肽與尿素發生非特異反應、肽段背向折疊 (backfolding) 和聚集，造成二維凝膠堿性區域中蛋白質點的偽跡 (artifact) 和水平拖尾（streaking)。
用膦類化合物，如 TBP 或 TCEP 替換巰基試劑可以部分防止這類效應，但是由于這些試劑在電場中不穩定，會產生額外的偽跡。在等電聚焦之前，用碘乙酰胺、乙烯基吡啶或單體丙烯酰胺預先將蛋白質烷基化，都會因多肽烷基化不完全及等電點的變化而產生額外的偽跡。
過量使用羥乙基二硫醚（hydroxyethyldisulphide,HED)[商品化后商品名為 DeStreak(GEHealthcare)] 提供了 pH 下保持疏基處于還原狀態（通過質量作用）的方法，顯著提高了使用 IPG 膠條的堿性等點聚焦電泳的分辨率 (Olssonetal.,2002)。特別是在陽極樣品人口聯合使用上樣杯上樣或紙橋上樣時效果更佳，因為上樣時堿性蛋白質都帶著相同的酸性電荷進入梯度膠條，然后向陰極移動從而達到等電點 (而不是令它們向兩個方向都移動）。
當蛋白質進入到 IPG 膠條時，半胱氨酸側鏈上的巰基會立即被氧化成高度穩定的二硫化物混合物。這是一種高特異性的，可以阻止不需要的副反應的平衡反應（圖 30.4)。
使用 DeStreak 方法制備樣品時可以采用小量的 DTT，那么蛋白質便可在聚焦前保持還原狀態。然而需要注意的是，過量的 DTT 會將 HED 還原成 2-巰基乙醇, 這會導致更多拖尾①。
差異凝肢電泳
即便 IPG 膠條重復性越來越高，樣品制備和電泳條件更加嚴格，凝膠之間還是存在差異。差異表達蛋白質組實驗的成功依靠對單獨采集 (生物學上的) 樣本的重復的測量，同樣也需要技術上的重復 (對同一生物樣本的重復測量）以控制分析中產生的差異，如樣品采集、處理和凝膠之間的變化。通過運用 DIGE 技術 (FriedmanandLilley,2009;LilleyandFriedman，2004;Unluetal.,1997) 可以解決這些方面的挑戰。
1.染色和檢測
近來，二維凝膠電泳所用的熒光染料在發展和應用上獲得了重大進步。這些染料用于檢測和定量溶解在凝膠中的完整蛋白質種類。熒光染料特別提供了檢測的敏感性，其敏感程度至少大于等于銀染法（約 Ing)，并且還將豐度的線性動態范圍極大地提高了 3~4 個數量級 (銀染和考馬斯亮藍 R-250 染色法通常提供低于 1 個數量級的動態范圍）。
2.DIGE 和定量分析算法
1997 年，DIGE 法開始使用 (Unluetal.，1997)，此法將混合樣品的熒光標記的動態范圍與靈敏度應用于同一塊膠中，排除了共分析樣本中的分析性偏差 (幾種凝膠之間的）。
現在這一方法也能在一系列 DIGE 膠中應用，利用混合的樣本內對照，使遷移模式配準成為可能，從而標準化豐度比（abundanceratio)，為多變量實驗提供了非凡的統計支撐 (KarpandLilley，2005)。
簡而言之，這一方法要求事先用光譜區別明顯的熒光染料 (Cy2、Cy3 和 Cy5) 標記多種樣本，然后將樣本混合并在同一二維凝膠中分析。這一方法能排除幾種凝膠之間的偏差，并且相互獨立的突光影像也能被單獨記錄，用于單個分辨特征 (resolvedfeature) 中的蛋白質豐度變化的直接定量（圖 30.5)。這里用到了兩種不同的標記概念:「最少量」標記，即將占蛋白質總量約 5% 的賴氨酸中的 e-氨基進行標記廣充分」標記，即將蛋白質混合物中所有可標記的半胱氨酸「充分飽和」地進行標記。
在一系列含有不同的由 Cy3 或 Cy5 標記的凝膠中分析用 Cy2 標記的內參照時，DIGE 法最見成效，并有統計依據。重要的一點是，該 Cy2 標記的內參照是由實驗中所有樣本等量混合而成，并在多凝膠實驗的每一塊凝膠中都存在。由于個體樣本（由 Cy3 或 Cy5 標記) 與等份的 Cy2 基準混合物相混合，每種分辨特征 (resolvedfeature) 便可直接與凝膠中 Cy2 基準混合物中的同源特性（cognatefeature) 聯系起來。凝膠中的 Cy3:Cy2 與 Cy5:Cy2 之間的各種比例便能在不受幾種凝膠之間偏差的干擾之下算得，這些比例可用于實驗中另一些樣本中這一特性的所有其他衡量標準，不但技術性 (分析性) 誤差極小，而且有著強有力的統計學功效 (KarpandLilley,2005)。
DIGE 法也直接適用于多變量統計分析之中，如主成分分析和系統聚類。這些附加的統計工具能夠有效地幫助人們發現一組實驗樣本中的差異。重要的是，還能幫助確定差異中的主因素是否能夠描述生物性，或者能夠揭示樣本之間未曾預料到的 (或是在準備樣本時被帶入的) 差異，或者能夠精準定位出能對實驗刺激或分類作出集體反應的蛋白質亞群 [如見 Franco 等（2009);Friedman 等（2006;2007);Hatakeyama 等（2006);Suehara 等 (2006)。綜述見 Friedman 和 Lilley(2009);Lilley 和 Friedman(2004)]。
3.軟件分析工具
現在，一些軟件程序能輔助完成二維凝膠實驗 (無論是 DIGE 還是其他) 的定量分析。
這些程序最大的區別，便是在探測蛋白質特性 (界線）和幾種凝膠之間校準（aliSnment)/配準 (registration)(如基于載體的圖像變形）時的算法有所不同。總體而言，這些程序都提供了強有力的伴有單變量 (如 f 分布檢驗和方差分析) 和多變量 (如主成分分析和系統聚類）的統計分析的分析工具, 非常利于估量個體蛋白質特性和整體表達模式的豐度變化，該類模式能夠將描述生物學表型的變化和那些在實驗中未預料的偏差辨別區分。