再水化上樣是二維凝膠電泳樣品導入的最簡便方法，這一方法使得樣品緩沖液中的蛋白質樣品在 IPG 膠條吸收樣品溶液時被動導入，且蛋白質可以在整個 pH 梯度中均勻分布。在一些商品化的等電聚焦儀器中，IPG 膠條的再水化和聚焦可以用相同設備儀器完成，無需人工操作。這種儀器也可以進行所謂的主動再水化，即在膠條再水化上樣過程中接入低電壓 (30~50V)，在一些情況下, 主動再水化可以促進樣品應用，因為這促使鹽離子向電極移動，去除了蛋白質中的蛋白酶，并幫助大分子進入凝膠之中。然而, 等電聚焦過程中的 IPG 膠條再水化方法 (正面朝下) 有些時候也會出現較低分辨率的情況，這是由于等電聚焦膠條的多余的機械應力加在了聚焦托盤和塑料凝膠襯底之間，蛋白質數量較多時這種情況尤為常見。在這些情況下，使用聚焦儀器，并讓塑料襯底直接與聚焦托盤接觸 (凝膠便會正面朝上），可利于更為復雜困難的樣品（圖 30.3)。
(6) 可選項：主動再水化 (在一些設備配置下可以進行）。當梯度膠條正面朝下并和電極接觸時，樣品的再水化即可發生。再水化過程中，電極會在膠條上產生較低（通常 30~50V) 電場。在一些情況下，主動再水化能夠促使高分子質量蛋白質進人梯度膠條之中。在這種配置下，等電聚焦儀器一開始聚焦于正面朝下的梯度膠條之上，而這時并不需要人工干預。
使用堿性范圍的 IPG 肢進行等電聚焦
再水化上樣的一大優點便是省去了許多人工操作步驟。然而，它也有許多不足之處, 特別是在堿性 pH 范圍中，因為在堿性環境中蛋白質會在膠條表面聚集, 并在二維凝膠中留下水平拖尾。
與酸性范圍相比 JPG 膠條在堿性范圍的電泳條件有所不同。在堿性 pH 環境下的等電聚焦過程，存在著還原劑 DTT 的水轉運與遷移。為了將這些影響降到最低, 蛋白質樣品通常在陽極一端進行杯上樣, 而不是進行凝膠內再水化（圖 30.3)。堿性膠的最大蛋白質載量低于酸性膠。強烈建議，每杯蛋白質上樣不要超過 0.5 mg, 以防拖尾。
以下方法用于 pH3~11 和 pH7~11 的 24 cmIPG 膠條。
(1) 確保最終樣品體積不超過上樣杯容量 (通常為 100~120 ML, 具體參照制造商規定的容量 (2) 在溶脹盒中，IPG 膠條在含有羥乙基二磺化物 (HED) 的再水化緩沖液 (不含蛋白質樣品）（DeStreak;01ssonetaL,2002) 中進行再水化。在這一階段，可加人終濃度為 0.5% 的 IPG 膠條緩沖液，用以水平等電聚焦和垂直 SDS-PAGE。由于在再水化過程中無蛋白質存在，可將時間縮短至 6 h(為了讓再水化和聚焦在同一天進行），但是通常推薦將這一時間持續在 12 h 以上。
(3) 在完全再水化后，將 IPG 膠條放置于水平電泳系統，并將此系統冷卻塊溫度恒定于 20°C。
(4) 將潮濕的吸干紙鋪于再水化的 IPG 膠條兩端，電極放置到位。將上樣杯小心放置在陽極 (即梯度的酸性一端) 正下方，這樣一來，杯底便可直接和 IPG 膠條頂部接觸并密合，但不會破壞凝膠。再將石蠟油覆蓋于膠條之上。
(5) 確保石蠟油不會漏入杯中, 然后向杯中加入 1 0~2 0 的石蠟油，小心地用移液器在石蠟油下移取樣品 (具體每杯最大樣本容量應參照制造商規定的容量)③。
(6) 表 30.1 為典型的聚焦方案.
IPG 膠的平衡
等電聚焦完成后，在進行第二維電泳之前有必要先對 IPG 膠條分兩個步驟進行平衡。電滲（electroendosmoticeffect) 會導致一維到二維轉換的效果變差，而平衡緩沖液中含有 6mol/L 尿素和 30% 的甘油，可降低電滲的影響（Sanchezetal.,1997)。并且，平衡緩沖液中含有 2%(W/V)SDS, 使蛋白質帶上負電荷以進行 SDS-PAGE。在平衡過程中及后續一維到二維的轉換過程中，蛋白質的損失主要是因為蛋白質被 IPG 膠基質較強吸收以及沖洗的原因。大部分蛋白質損失都發生在平衡過程的前幾分鐘，而在平衡過程的第二個步驟中，蛋白質損失極少 (Sanchezetal.，1997)。
(1) 在聚焦完成之后，將石錯油從 IPG 膠條上移除, 并將 IPG 膠條孵育在平衡緩沖液之中。這一步驟可以在各種容器、密封管，甚至是在平底的 IPG 膠條聚焦支持面上進行，以最大限度減少對膠條的操作。
(2) 膠條首先在 25~100 mL 的平衡緩沖液中進行平衡 (15~20 min), 緩沖液中還含有 1%~2%(m/V) 的 DDT 以減少二硫鍵。
(3) 將溶液倒掉, 替換成等體積含碘乙胺酰 [為 DTT 用量的 2.5 倍的平衡緩沖液，再孵育 15~20 min, 使已形成的巰基被脲甲基 (凈分子質量增加 57Da) 烷基化。這樣能夠防止巰基在二維 SDS-PAGE 時再次氧化，從而防止蛋白質拖尾禮 (4) 這時便可將平衡后的 IPG 膠條在二維 SD&PAGE 凝膠上進行電泳，或包兩層塑料膜，將其冷凍儲存在一 20°C 或一 80°C 數月。對于標記 DIGE 的樣本來說，以此方法儲存可在至少一周內不影響 Cy 染料的性能。如有需要，可在聚焦之后，用此方法直接將 IPG 膠條冷凍，將平衡和還原/烷基化步驟留到需要二維分離時再完成。
SDS-PAGE: 第二維
在平衡過程結束之后，膠條便可用于第二維 (SDS-PAGE)。當超過一塊凝膠需要進行電泳時 (在比較蛋白質組學中很常見），凝膠一起進行電泳可獲得最具可重復性的結果。
通常需要使用可承載 10~12 個大規格（24 cmX20 cm)SD&~PAGE 凝膠的電泳棺, 這種電泳槽在市面上可以買到。為了提高重復性、降低電泳過程中 SDS 的損耗, 建議使用冷卻系統使緩沖液保持在 20°C。
自制的凝膠使用普遍、價格適宜，但需要大量人力重復制備。現成的預制凝膠在市面上也可購得, 包括用于 DIGE 的使用弱熒光支撐介質的凝膠。不同交聯劑比例（丙烯酰胺：雙丙烯酰胺) 的丙烯酰胺濃縮液也可使用。對于一般用途而言，12% 均一孔徑凝膠 (12%T、26%C) 能夠在便于制備和分辨率上達到最好的折中效果。梯度凝膠在更廣的質量范圍中分離效果和分辨率更好, 但卻更難大規模重復制備。重復制備梯度凝膠專用的制膠器也可在市面上買到。
人工灌制的凝膠可借助多凝膠制膠器單獨制作或批量制作。每份多凝膠灌制時所需要的丙烯酰胺溶液總量可根據每塊獨立凝膠的設置和裝備提前確定。下面是終體積為 2.3L 的多凝膠制備的一個例子。若要求更小體積, 成比例地調整用量即可。
(1) 通常，用塑料板將有 1.0 mm 或 1.5 mm 厚度帶有墊片的玻璃板分開，以防止凝膠聚合作用以后玻璃板之間相互粘連。如果需要，可在凝膠灌制之前在玻璃板之間放人寫字的 Whatman 濾紙，以便給每塊凝膠一個唯一的連續識別號碼。
(2) 在真空瓶中加入 920 mL3 0%(m,V) 丙烯酰胺-雙丙烯酰胺; 容液，其中丙烯酰胺！雙丙烯酰胺為 37.5:1，再加入 575 mLI.5mol/LpH8.8 的 Tris-HCl 及 770 mL 水 [見步驟 (4)]。
(3) 混合物抽氣處理 10 min, 以移除微小氣泡, 這些氣泡在某些情況下會干擾聚合作用，并在蛋白質染色后引起點拖尾。
(4) 可選項：脫氣后，可將 SDS 加人到丙烯酰胺溶液中, 終濃度為 0.01%(35 mL 水中加人 2.3 g)。然而，許多研究表明，這一階段不需加入 SDS 也可以獲得品質好的溶液，最有可能是因為攜帶蛋白質通過凝膠的 SDS 在平衡階段和/或電泳緩沖液作用下已經與蛋白質結合 (并且在電泳開始階段，電場產生時，凝膠中的任何 SDS 都會在蛋白質進人凝膠前離開凝膠）。如今許多商業渠道都會提供含有或不含 SDS 的預制凝膠。若本步驟不使用 SDS，則要在步驟 (2) 中將 770 mL 加水量替換成 805 mL[見步驟 (2)]。
(5) 在灌膠之前，要采取溫和方式或用一個攪拌棒混勻，在丙烯酰胺混合物中加入 7 00 mg 過硫酸銨 (APS，現用現配) 和 300TEMED(根據不同灌膠裝置，丙烯酰胺混合物用量減小時，APS 和 TEMED 的用量也應成比例地減少）。
(6) 制備多凝膠所用的槽需要從底部開始澆注，至離玻璃板頂部 2 cm 的高度即可。小心地在凝膠上覆蓋 I.0~I.5 mL 緩沖液飽和的異丁醇，使聚合作用開始
(7) 在聚合作用完成之后，清理制膠玻璃板上剩余的聚丙烯酰胺殘留物，用水或 SDS 電泳緩沖液覆蓋，用雙層塑料薄膜封蓋，可在 4°C 保存幾周。
(8) 若先前的第一維 IPG 膠條 (已平衡和還原/烷基化) 被冷凍過，在解封和操作這些膠條前先放置幾分鐘使其完全解凍。沖洗并除去第二維凝膠玻璃板頂部空間中的水或 SDS 電泳緩沖液。
(9)IPG 膠條應該浸泡在 SDS 電泳緩沖液中，隨后放置在 SDS-PAGE 凝膠裝配的頂部孔空間內。梯度膠條背后的塑料襯片需要黏附在其中一塊玻璃板的內表面 (如果可以的話通常是較長的那塊玻璃板），并且隨后可以簡單地用薄卡片或尺子輕觸放入合適位置 (確保卡片或尺子壓力是作用在塑料襯片上而不是 IPG 凝膠上）。SDS 電泳緩沖液覆蓋在電泳槽內后，使用同樣的輕觸步驟可以輕易地移除氣泡，實現 IPG 膠條與二維凝膠的良好接觸。裝置裝配完畢后，在第二維電泳運行中不可以再移動 IPG 膠條。
(10) 可選項。為確保 IPG 膠條和凝膠良好接觸，可以使用瓊脂糖溶液以保持 IPG 膠條處于適合位置。瓊脂糖溶液需保溫在 65°C 并先被加入到凝膠頂部。隨后立即將平衡后的 IPG 膠條放在凝膠上面。有些人贊成這么做, 但這確實是一個笨拙的方法, 并且若在膠條放置完畢和氣泡移除前瓊脂糖溶液就凝固的話，將會變得難以處理。
(11) 可選項。蛋白質分子質量標準可在旁側進行電泳 (通過小塊紙片上樣）。
(12) 初期將電流設置為每塊凝膠 5~10mA 以使蛋白質進入凝膠，隨后設置電流為每塊凝膠 20mA，l5°C 過夜直至藍色前沿到達凝膠末端。有條件的話采用恒定功率，至少在第 Ih 要將功率設置為每塊膠小于 IW，隨后功率每塊膠不大于 15W 直到完成，這是最優設置，因為電泳時隨著鹽和離子離開凝膠，電壓和電流強度將會發生改變。
電泳完成之后，固定凝膠并采用各種各樣的可視和熒光染色技術對凝膠染色。通過熒光成伐，DIGE 膠可在第二維電泳完成后立即成像。隨后可以將凝膠放在冰箱或 4°C 冷藏間里保存幾個月。經二維電泳并長時間保存后的蛋白質，采用質譜分析儀來鑒定是沒有任何問題的叭。