多羥基反應單克隆抗體的鑒定、生產和使用——用于...（三）

說明

(1) 用 IntegraCL350 瓶培養雜交瘤細胞的效果很好, 每毫升細胞培養收獲上清液中，可以得到 mAb0.5~Img。通常可連續培養 1 個月左右。

(2) 處理液體：將培養基在 37°C 水浴預熱。這有助于避免培養瓶中的冷凝作用以及細胞的溫度休克向細胞培養皿 (白蓋) 添加或取出液體時, 要先擰松營養培養室的綠蓋，以防止留有空氣。放人培養箱孵育之前始終擰緊培養瓶的白蓋和綠蓋。建議使用 IOmL 血清移液管進行操作。將培養基吸出并加人新鮮的培養基, 為營養維持室換液。

(3) 接種的最低細胞濃度為 1.5X106 個細胞/mL[步驟 (2)]。我們嘗試降低營養培養基中所需的胎牛血清，但未獲成功。一些市場上的新型無血清培養基可以用做營養培養基。

(4) 監測細胞數量和狀態很重要 [步驟 (3)]。有助于確定是否分離細胞，以減少細胞數量，避免總活細胞數大于 I.OXlO8 個。如果細胞活力大大降低，則需要增加換液頻率。

(5) 在連續培養過程中，由于每次收獲均分離細胞，引起細胞死亡而導致活細胞比例 [步驟 (4)] 下降。培養期末, 僅有 30%~40% 活細胞是非正常終止的。

(6)—些雜交瘤細胞在長期連續培養時是不穩定的, 并失去產生抗體的能力。因此，在培養期間應監測抗體生成。我們采用標準 ELISA 檢測。

(7)CELLine 培養瓶的信息可以在 www.integrabiosciences,COM/celline 獲得。

5.抗體純化

為將抗體與載體上可用反應位點間的結合最大化, 需要純化抗體，至少部分純化也是有益的。可以用多種不同的方法純化抗體。其中最經濟實用的方法是分子排阻色譜或離子交換層析。常用的純化方法是利用 ProteinA、ProteinG，或兩者混合進行親和層析, 但這種方法耗費較髙。小鼠 111 八 1) 屬于免疫球蛋白化 04 個亞類之一：^0 1、：^02&、龜 02 匕和 IgG3。小鼠 IgG2a、IgG2b 和 IgG3 可以用 ProteinA 層析柱純化。小鼠 IgGl 與 ProteinA 結合的效果差。與小鼠 IgG2a 不同，小鼠 IgGl 與 ProteinG 結合效果更好，而 IgG2b 與 ProteinA 和 ProteinG 均可結合。

根據我們的經驗，大部分典型融合實例中的單抗都是 IgGl 亞類。這里我們介紹一種 DEAE 柱 (WhatmanDE52)，可以用于純化小鼠 IgGmAb，該層析柱既經濟，又簡單。

對于 mAbIgGl, 這種方法特別有效。事實上，在我們的操作中，每個純化后的 igG1mAb，經檢測純度均可達 90% 左右。此外，許多小鼠的 IgG2a 和 IgG2b 抗體可以通過這種方法純化。

(1) 無論是腹水或 CELLine 細胞培養上清液中的抗體均需采用硫酸銨沉淀。向 mAb 中加飽和硫酸銨溶液至奶％ 飽和度。冰上攪拌漿體 2 0 min。通過這種方式沉淀 mAb，同時大部分血清白蛋白留在溶液中。

(2) 離心分離沉淀 (約 6000 盡,10 min)。向沉淀中加入抗體用緩沖液 [50 mmol/LTris-HCKpH6.9),25 mmol/LNaCl], 加入量為抗體初始體積的 l/4(CELLine 培養瓶制備抗體).1/2(腹水)。

(3)15 min 左右可溶解沉淀，離心使其澄清 (約 6000IOmin)。

(4)4°C 條件下，將步驟 (3) 得到的上清液用 IL 抗體用緩沖液透析過夜。

(5) 澄清的上清液用于 DE52 柱層析，按照下面「說明」中事項準備層析柱。層析柱用抗體用緩沖液 (pH6.9) 平衡, 該 pH 條件下，大部分 mAb 流穿，而多數雜質會與層析柱結合。10 mL 原料可用 5 mLDE52 柱。

(6) 收集原料中未與層析柱結合的組分 (約 ImL)，每個組分樣品進行 SD&PAGE 檢測。CL350 培養瓶制備 mAb8RB13(IgGl 型單抗），純化產物的 SDS^PAGE 結果如圖 28.2B 所示。根據抗體純度合并分離組分。

(7) 用 5 mL 含 0.5mol/LNaCl 的抗體用緩沖液洗脫層析柱,PAGE 分析前保存洗脫液。

說明

(1)DE52 的準備工作十分重要。雖然生產商宣稱不需要預循環, 但是我們證實預循環大大改善了色譜性能。10 g 樹脂混懸于 100 mL 水中, 并用 100 mL 水清洗數次, 每次清洗可去除細小物 (不沉降的小顆粒)。然后用 100 mL0.Imol/LHCl 處理樹脂 30 min, 將 HCl 緩慢倒出。至少清洗 3 次樹脂, 每次用 100 mL 水。最后一次清洗緩慢倒出液體，然后用 0.Imol/LNaOH 處理樹脂 30 min, 緩慢倒出液體，至少清洗 3 次樹脂，每次用 100 mL 水。用抗體用緩沖液清洗樹脂 3 次，每次用 100 mL 緩沖液, 并用相同的緩沖液懸浮。用 pH 試紙檢測 pH，加人疊氮鈉至終濃度 0~ 0 2%。樹脂分裝于一次性試管，存放于冰箱內。

(2)mAb 可來源于腹水。雖然腹水并不純 (純度 80%~90%), 但雜質可能并不影響免疫親和樹脂的性能。

(3) 在上述條件下，大多數小鼠 mAb 可流穿 DE52。但仍有少量 mAb 可以結合于層析柱。因此，可以采用高鹽洗脫條件 [步驟 (7)] 洗脫抗體。使用鹽梯度濃度純化與 DE52 層析柱結合的 mAb 是必要的。

(4) 如果以 CELLine 培養瓶制備 mAb，可不必采用 DE52。

6.PR-mAb 在層析載體上的固定

供應商提供了很多種樹脂和偶聯劑。我們已經對其中的大部分進行了驗證，但沒有任何一種比用溴化氰 (CNBr) 衍化的交聯瓊脂糖更有效。

（1）純化后 mAb 用偶聯緩沖液透析 (1 00 mm o l/LNaHCO3、500 mmol/LNaCUpH8.3)。移出透析管中的抗體溶液，并用偶聯緩沖液調整其體積，每克溴化氰活化的 Seph-arose 干粉對應 10 mL, 留樣 (約 1 00^L) 分析蛋白質濃度。

（2）約需 20 min 溴化氰活化的 Sepharose 干粉即可溶脹于 0.Immol/LHC1。每克溴化氰活化樹脂干粉可制備 3.5 mL 凝膠。然后在玻璃濾器內清冼樹脂，每克樹脂用約 100 mL0.Immol/LHCl。

(3) 用約 20 mL 偶聯溶液快速清洗樹脂后，將樹脂轉移至抗體溶液中。23°C 條件下，用實驗室旋轉器將膠漿液翻轉混合 2 h。

(4) 用玻璃過濾器收集樹脂, 保存濾液用于測定未偶聯蛋白質含量。

(5) 將樹脂轉移至約 1 0 1111^1”[8.3、1111 0 1/1 乙醇胺溶液中,23。(：翻轉混合 211, 使乙醇胺與殘余的溴化氰充分反應。

(6) 再次用玻璃過濾器收集樹脂，偶聯緩沖液 (約 50 mL) 清洗后，用 100 mmol/L 乙酸鈉緩沖液 (pH4.0) 清洗。

(7) 重復至少 2 次或 3 次步驟 (6) 中的 2 次清洗。

(8)4°C 條件下，將偶聯的 Sepharose 保存于 I0 mL 含 0.02%NaN3 偶聯緩沖液中。

(9) 檢測結合前后保存的抗體溶液 [步驟 (1) 和 (4) 得到的樣本] 中的蛋白質含量。據此確定偶聯效率。

說明

(1)Ig 樹脂干粉制備 3.5 mL 溶脹樹脂。我們發現多數情況下，—次處理 0.5~2.0 g 樹脂干粉比較方便。并且證實 ImL 溶脹樹脂偶聯 2.5 mgmAb 效果較好。因此，3.5 mL(lg) 樹脂需要結合 8.75 mgmAb。

(2) 溴化氰活化的 pH 條件是 8 以上。因此, 上述步驟 (3) 中的抗體溶液應盡快轉移至樹脂。

(3) 阻斷劑 [步驟 (5)] 可依據具體使用目的而異。例如, 產自酵母的乙醇胺結合蛋白，如果用乙醇胺作為阻斷劑，將會與目標蛋白質共純化。在這種情況下，almol/L 甘氨酸是比較合適的阻斷劑。

(4)4°C 條件下，將樹脂儲存于 0. 0 2%NaN3 中。該條件下，樹脂可以穩定儲存約 6 個月。我們注意到，一些抗體儲存 6 個月后會發生剝離。向上述緩沖液中加入 50% 甘油，存儲于 20°C(不凍結），可能延長半衰期。

7.用 PR-mAbs 純化蛋白質

下面我們以 mAbNT73 或 8RB13 純化大腸桿菌來源的 RNA 聚合酶為例。前面介紹一步免疫親和層析法可以得到純度約 90% 的 RNA 聚合酶。其他一些與 RNA 聚合酶結合的蛋白質也會被共同洗脫。該操作規程設定原料為 IL 對數生長末期培養液獲得大腸桿菌沉淀（2~3 g 濕重）。圖 28.3 所示 SD^PAGE 結果為利用該方法純化的結果。

(1) 可以在冰上部分復融沉淀，并用 20 mLTEN 緩沖液 [50 mmol/LTris-HCl(pH7.9)、0.Immol/LEDTA、100 mmol/LNaCl] 重懸。

(2) 添加溶菌酶至終濃度 250pg/mL, 冰上孵育細胞 20 min。或者使用 1500kU 重組溶菌酶 (EMD/Novagen 公司#H110)。

(3) 冰上超聲細胞, 重復 4 次，每次工作 15s，間歇 15s。

(4)15000r/min(27000 g) 離心裂解液 15 min。

(5) 于 23°C 將上清液 (1~2 mL) 上樣于免疫親和柱，收集流穿部分。

(6) 用含 100 mmol/LNaCl 的 TE(約 20 mL) 清洗層析柱，然后再用含 500 mmol/L(原文為 500 mL, 譯者認為原文筆誤）NaCl 的 TE(約 5 mL) 清洗層析柱。用含 100 mmol/LNaCI 的 TE(約 10 mL) 再平衡。

(7) 用含 0.75mol/LNaCl 和 40% 丙二醇的 TE 洗脫層析柱 (室溫）。冰上收集洗脫組分。

(8)SDS-PAGE 電泳分洗脫峰。圖 28.3 中 SDS-PAGE 結果顯示一步層析產物純度。合并所需組分（圖 28.3 泳道 5、泳道 6)，用合適的儲存緩沖液透析 [轉錄蛋白，用 50 mmol/LTris-HCl(pH7.9),50 mmol/LNaCUO.Immol/LEDTA.O.lmmol/LDTT 和 20%~50% 甘油]。