下文所述的以細胞提取物的產品質量為出發點的各種策略和指導方針適用于大多數下游純化及分析過程。盡管介紹的重點是在小規模或較大的實驗室規模的大腸桿菌裂解上，但是一些技術還是可以用于其他來源的細胞裂解和細胞內蛋白質提取，并且是可以放大的。廣泛的蛋白質純化方面的文獻為這里列出的一些蛋白質提取物制備方針及蛋白質純化和鑒定提供了補充信息 (Burgess,1987;Deutscher,1990;HarrisandAngal，1989;Hopkins，1991;Marshaketal.，1996;Scopes，1994)。
細胞裂解緩沖液的成分和體積不僅對細胞的有效裂解至關重要，而且還將影響隨后的純化過程及目標蛋白質從細胞中釋放出來后的穩定性和回收率。每種提取的蛋白質都是獨特的，理論上應該有一種與其自身的生化性質和預期的純化流程都相適應的提取及純化的緩沖液存在。在大多數的案例中，如果幾個基本條件符合了, 多數的普通提取緩沖液都能取得很好的結果。這些基本條件包括 pH、離子強度、防止降解和改善穩定性的添加劑、緩沖液與細胞的比例等。一個對于通過緩沖液成分和其他方法保持酶活性的非常好的參考資料是 Scopes(1994) 的蛋白質純化 (ProteinPurification)。pH 和緩沖液的技術信息都能夠通過 Dawson 等 (1986) 找到，其中包括制備 pH1~13 的緩沖液的表格、緩沖液性質和鹽的影響、溫度、稀釋度。
提取緩沖液的
pH 選擇應該在蛋白質等電點之上或之下至少一個單位。這種不同于 Pl 的 pH
能夠通過保持蛋白質表面的正電荷或負電荷來防止等電沉淀，還有利于離子交換作為純化的一個步驟。為了保持緩沖能力和最小電導率的增加，緩沖液的離子強度應該為
20~50 mmol/L，所采用緩沖鹽類的 pKa 在所采用的 pH0.5 單位以內。典型細胞細胞質的離子強度為 150~200
mmol/L，這其中含有很高濃度的與離子化蛋白質相互作用的帶電荷的生物活性分子。裂解緩沖液至少應含有 50~100_ol/L 的
NaCl。提高裂解緩沖液的離子強度將會降低這些離子的相互作用力，并且減少帶電粒子的沉淀。這些沉淀會吸附蛋白質，雖可以通過離心或過濾的步驟去除但因此會造成目標蛋白質的損失。最后，緩沖液中應添加可以防止蛋白質降解、提高蛋白質穩定性的物質作為必需的成分。這包括蛋白酶抑制劑
(表 18.2)、還原劑 [如二硫蘇糖醇 (dithiothreitol，DTT)]、磷酸三 (P-氯乙基）醋
[tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP]、三（3-輕基丙基）膦
[tris(hydroxyprophl)phosphine，THP]、二價陽離子、輔因子、kosmotropes(如甘油、山梨醇或海藻糖)。水溶的無氣味磷化氫類的
TCEP 和 THP 都非常穩定，并且比大多數通常使用的硫氫基還原劑/9■巰基乙醇 (浐 mercaptoethanol) 和 DTT
等對保持還原狀態的二硫鍵更加有效
(Clineetal.，2004;Getzetal.，1999;HanandHan,1994)。可以添加非離子的和兩性的去垢劑以增加疏水性蛋白質的溶解度。還原劑、蛋白酶抑制劑和去垢劑會干擾一些純化過程及檢驗檢測分析方法的結果。在選用緩沖液中所采用的化學制劑和其濃度時，這些成分的潛在干擾必須要考慮。對于大腸桿菌細胞裂解所采用的萬金油緩沖液
B(bufferB) 為:50 mmol/LTris-HCl 或者是憐酸鈉 pH7.5~8,0、50 mmol/L NaCl、5%
甘油、0.5 mmol/LEDTA 和 0.5 mmol/LDTT。推薦采用酵母的裂解緩沖液 (bufferY) 和昆蟲細胞的裂解緩沖液
(bufferI) 的配方在下文中會給出。
為了有效地裂解菌體，并保證通過離心和過濾去除不溶的細胞組分沉淀物質后的提取液的回收效率，用來重懸細胞的緩沖液的體積至少要達到原始細胞體積的 3 倍以上。
因為不溶物會吸附約自身體積 50% 的液體，所以至少采用 3 倍體積的緩沖液才能保證最高 85% 的液體回收率。蛋白質在髙濃度下更加穩定，但是高濃度的提取液難以操作，并且會發生蛋白質聚集。盡管裂解緩沖液與細胞體積的比例為 3:1 可以得到濃度更高的提取液, 但是 5~10 倍體積的緩沖液是更加優先選擇的，而且能夠得到更多的可溶性的蛋白質和更低的提取物黏度。
注意: 在這些緩沖液中，蛋白酶抑制劑可以添加也可以被省略 (表 18.2)，這要看目標蛋白質對蛋白酶水解的敏感性，以及所需要的抑制劑的量和種類。如果起始的蛋白質分離步驟是離子交換色譜法，那么緩沖液 I 和緩沖液 Y 的離子強度可以降低或者提取完畢后再進行稀釋。