（三）操作方法
1．安裝夾心式垂直板電泳槽
夾心式垂直板電泳槽操作簡單，不易滲漏。這種電泳槽兩側為有機玻璃制成的電極槽，兩個電極槽中間夾有一個凝膠模，該模由一個上框形凝膠框、長與短玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成。電泳槽由上儲槽（白金電極在上或面對短玻璃板），下儲槽（白金電極在下或面對長玻璃板）和回紋狀冷凝管組成。兩個電極槽與凝膠模間靠儲液槽螺絲固定。各部間依下列順序組裝：
（1）將上儲槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。
（2）將上、短玻璃板分別插到上框形硅橡膠的凹形槽中。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。
（3）將已插好玻璃板的凝膠模平放在上儲槽上，短玻璃板應面對上儲槽。
（4）將下儲槽的銷孔對準已裝好螺絲銷釘的上儲槽 ，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽 。
（5）豎直電泳槽，在長玻璃板下端與硅膠模框交界的縫隙內加入已融化的1%瓊脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂（糖）中應避免有氣泡。
2．配膠
① 分離膠 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中，凝膠緩沖液（pH8.9）2.5ml，分離膠貯液5.0ml，重蒸餾水2.5ml，充分混勻，抽氣10min，最后加AP 10 ml。
② 濃縮膠 pH6.7 25% PAA：濃縮膠緩沖液∶濃縮膠貯液∶40%蔗糖溶液∶核黃素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合。
3．制備凝膠板
不連續體系采用不同孔徑及pH的分離膠與濃縮膠 ，凝膠制備應分2步進行。
① 分離膠的制備：根據實驗要求，選擇最終丙烯酰胺的濃度，本實驗需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液，其加膠方式不同于連續系統。混合后的凝膠溶液，用細長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1cm注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水（約3-4mm）用于隔絕空氣，使膠面平整。為防止滲漏，在上、下儲槽中加入略低于膠面的蒸餾水。約30-60min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。用濾紙條吸去多余的水，但不要碰破膠面。如需預電泳，則上、下儲槽的蒸餾水倒去，換上分離膠緩沖液，10mA電流電泳1h，終止電泳后，棄去分離膠緩沖液，用注射器取濃縮膠緩沖液洗滌膠面數次，即可制備濃縮膠。
② 濃縮膠制備：濃縮膠為pH6.7 25% PAA，混合均勻后用細長的滴管將凝膠溶液加到長、短玻璃板的窄縫內（即分離膠上方），距短玻璃板上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板。在上、下儲槽中加入蒸餾水，但不能超過短玻璃板上緣。在距離電極槽10cm處，用日光燈或太陽照射，進行光聚合，但不要造成大的生溫。在正常情況下，照射6-7min，則凝膠由蛋黃透明變成乳白色，表明聚合作用開始。繼續光照30min，使凝膠聚合完全。光聚和完成后放置30-60min，輕輕取出樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體，加入稀釋10倍pH8.3的Tris-甘氨酸電極緩沖液。使液面沒過玻璃板約0.5cm，即可加樣。
4．加樣
作為分析用的PAGE加樣量僅需幾微克，2-3ul血清電泳后就能分出幾十條蛋白區帶。為防止樣品擴散，應在樣品中加入等體積40%蔗糖（內含少許溴酚蘭）。用微量注射器取5ul上述混合液，通過緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內都加了樣品，即可開始電泳。
5．電泳
將直流穩壓電泳儀的正極與下槽連接，負極與上槽連接（方向切勿接錯）。接通冷卻水，打開電泳儀開關，開始時將電流調至10 mA 。待樣品進入分離膠時將電流調至20-30mA。當藍色染料遷移至距離橡膠框下緣1cm時，將電流調回到零，關電源及冷卻水。分別收集上、下貯槽電極緩沖液置試劑瓶中，4℃貯存還可用1-2次。旋松固定螺絲，取出硅橡膠框，用不銹鋼鏟輕輕將一塊玻璃板撬開移去，在膠板一端切除一角作為標記，將膠板移至大培養皿中染色。
6．固定，染色
本實驗采用0.05%考馬斯亮藍R250（內含20%磺基水楊酸）染色液，染色與固定同時進行，使染色液沒過膠板，染色30min左右。
7．脫色
用7%乙酸侵泡漂洗數次，直至背景藍色褪去。如用50℃水浴或褪色搖床，則可縮短褪色時間。脫色液經活性碳脫色后，可反復使用。
（四）注意事項
1．制備凝膠應選用高純度得試劑，否則會影響凝膠聚合與電泳效果。Acr及Bis是制備凝膠得關鍵試劑，如含有丙烯酸或其它雜質，則造成凝膠聚合時間延長，聚合不均勻或不聚合，應將它們分別純化后方能使用。Acr及Bis均為神經毒劑，對皮膚有刺激作用，實驗表明對小鼠得半致死量為170mg/kg，操作應在通風中進行。Acr的純化：稱70gArc溶于1000ml 50℃預熱的氯仿中，溶解后趁熱過濾。冷卻后，置-20℃低溫冰箱中，則有白色結晶析出，用預冷的布氏漏斗抽濾，收集白色結晶，再用預冷的氯仿淋洗幾次，真空干燥后置棕色瓶中密封儲存。Acr的熔點為84.5+0.3。純Acr水溶液pH應是，其pH值變化不大于0.4pH單位就能使用。Bis的純化：稱12gBis，使其溶于1000ml預熱40-50℃ 的丙酮中，趁熱過濾。冷卻后，置-20℃ 低溫冰箱中，待結晶析出后，用預冷的布氏漏斗抽濾，收集結晶，用預冷丙酮洗滌數次，真空干燥后置棕色瓶阿訇密封保存，Bis熔點為185℃。Acr和Bis的儲液在保存過程中，由于水解作用而形成丙烯酸和NH3，雖然溶液放在棕色試劑瓶中，4℃儲存能部分防止水解，但也只能儲存1-2個月，可測pH值（4.9-5.2）來檢查試劑是否失效。
2．由于與凝膠聚合有關的硅橡膠條、玻璃板表面不光滑潔凈，在電泳時會造成凝膠板與玻璃或硅橡膠條剝離，產生氣泡或滑膠；剝交時凝膠板易斷裂，為防止次現象，所以器材應嚴格地清洗。硅橡膠條的凹槽、樣品槽模板及電泳槽用泡抹海綿蘸取“洗潔凈”仔細清洗。玻璃板侵泡在重鉻酸鉀洗液3-4h或0.2mol/LKOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗凈，再用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”反復刷洗，最后用蒸餾水沖洗，直接陰干或用乙醇沖洗后陰干。
3．安裝電泳槽和鑲有長、短玻璃的硅橡膠框時，位置要端正，均勻用力旋轉緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏。樣品槽模板梳齒應平整光滑。
4．用瓊脂（糖）封底及灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。
5．凝膠完全聚合后，必須放置30min-1h，使其充分“老化”后，才能輕輕取出樣品槽模板，切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳區帶扭曲。
6．為防止電泳后區帶拖尾，樣品中鹽離子強度應盡量低，含鹽量高的樣品槽可用透析法或凝膠過濾法脫鹽。最大加樣量不得超過100ug蛋白/100ul。
7．在不連續電泳體系中，預電泳只能在分離膠聚合后進行，洗凈膠面后才能制備膿縮膠。濃縮膠制備后， 不能進行預電泳，以充分利用濃縮膠的濃縮效應。
8．電泳時，電泳儀與電泳槽間正、負極不能接錯，以免樣品反方向泳動，電泳時應選用合適的電流、電壓、過高或過低均可影響電泳效果。
9．電泳后，應分別收集上下儲槽電極緩沖液，在冰箱儲存，可用2-3次。為保證電泳結果滿意，最好用新稀釋的緩沖液。