Raf 蛋白 Ras 結合結構域的簡并進化庫合成以及利用片段互補法快速篩選二氫葉酸還原酶的快速折疊且穩定的克隆實驗
實驗材料 寡核苷酸引物Tag 聚合酶BL21 電轉感受態細胞
試劑、試劑盒 氨芐青霉素卡那霉素
儀器、耗材 瓊脂糖凝膠
實驗步驟
3.1 概論
3.1.1 PCA 對空間排列的要求
PCA 片段的三維朝向對于 PCA 報告蛋白是否能正確折疊至關重要，它取決于形成復合體的目的蛋白 N 端或 C 端的朝向（圖 15.1 示意了在連接設計中對空間位置的考慮）。因此，在設計蛋白一PCA 片段融合體時，以何種方式將蛋白質片段連接在一起使其能夠折疊形成天然結構是非常重要的。融合蛋白能否正確折疊受融合蛋白的末端朝向和片段間接頭（linker) 長度兩個因素的影響。我們將片段 GGGGS 應用于多種不同蛋白質，證明這個序列在大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞表達系統中效果都比較好。我們認為這個序列可以改善融合蛋白的彈性和可溶性，從而有利于其組裝，而且由于此序列中不含天然蛋白酶識別位點，確保了融合蛋白的穩定性。雖然此類的接頭受到青睞，但并不表示使用它就一定能得到可以互補的片段 [ 31，32，39] 。然而，還是要避免使用諸如脯氨酸和分支氨基酸類的大的疏水和剛性氨基酸。在大多數蛋白質工程的問題中，形成復合體的目的蛋白的三維結構是已知的，因此可以設計復合體的方向并計算出所需接頭的長度。對于 DHFR PCA 來說，融合蛋白 N 端和 C 端的空間構象需求是已知的 [ 31，44 ] 。例如，如果將目的蛋白分別與F[ 1 ，2 ] 的 C 端和 F[ 3 ] 的 N 端融合，那么構建時所需的接頭就可以很短甚至不需要，因為這種構建方法已經考慮到了 DHFR 的拓撲結構；但是如果將目的蛋白分別構建到兩個片段的 N 端，要使 DNFR 能正確組裝，就必須在兩個融合蛋白之間插入至少兩個氨基酸作為接頭（每個肽鍵大約 3.75 A ) ，因為 DNFR 兩個片段 N 端的距離將近 10A。在 ras 和 RBD 的例子中就選擇了這種構建方式。然而，觀察 raf RBD 與 ras 髙類似蛋白 raplA 的復合體結構發現這兩個蛋白質的 C 端距離 40A，這就需要在每個融合蛋白中插入至少 6 個氨基酸的接頭。對于文庫篩選來說，我們將每個接頭的總長度定為 14 個氨基酸，其中包括限制性內切核酸酶位點，以確保融合蛋白具有足夠的靈活性。
3.1.2 對照和嚴密性
在利用 DHFR PCA 進行蛋白質工程研究和文庫篩選之前，必須做嚴格的對照實驗用以估計其對特定的測試系統的靈敏度和嚴密性。理想條件下，在進行文庫篩選前，實驗者應大概了解 PCA 對于一個給定的相互作用體的解離常數 Kd 的極限。不同的相互作用蛋白對有著不同的靈敏度極限（PCA 可以檢測到的最大 Kd )，但是 Kd 值又受到融合蛋白表達水平、蛋白質表達總量中可溶蛋白比例以及諸如穩定性、可溶性和蛋白質折疊、結合參數等蛋白質自身性質的影響。如果 PCA 十分靈敏，可以檢測到兩個特定蛋白質間非常弱的相互作用，它就不能在眾多的克隆中選出最好的相互作用蛋白對；也就是說，此項實驗過于靈敏從而喪失了嚴密性。因此，平衡靈敏度和嚴密性的關系至關重要。為了解決這一問題，在 PCA 實驗前通常需要做些對照實驗，雖然不是所有的這些對照都與特定的蛋白質工程研究相關，我們在后面還會再討論這個問題。
( 1 ) 偽組裝（spurious reassembly): 要使 PCA 能有效工作，應避免片段間微弱的或非特異性的相互作用。對于一個給定的相互作用蛋白對測試系統來說，PCA 有效的靈敏度可以通過對照 4 和 6 來估算。如果靈敏度過高，如長出不該有相互作用的蛋白對的菌落（圖 15.2A ) ，可以通過降低表達水平或通過對照 2 中所述的嚴密性突變來降低靈敏度（圖 15.2B)。
( 2 ) 嚴密性突變（stringency mutant)：突變 DHFR 兩片段相互作用表面上的氨基酸殘基側鏈的效果，如已報道的 F[ 3 ] 的 I114A 突變。在克隆表達通過形成亮氨酸拉鏈 ( leucin zipper) 而相互作用的蛋白對時，菌落生長速度和數量無法區分不同蛋白對間的結合效率。后來，在 F[ 3 ] 中引入突變 I114A，改變了 PCA 的靈敏度，使其可以應用于亮氨酸拉鏈系統。這種靈敏度的變化可以通過一步篩選的選擇因子（selection factor) 來衡量，選擇因子等于共轉化細胞數除以在選擇壓力下存活菌落數。數值越高嚴密性越高，所以在合理數量的重復競爭下，可以挑選出最好的相互作用亮氨酸拉鏈異源二聚體 [32]。
( 3 ) 片段置換（fragment sw apping)：無論將相互作用的兩個蛋白質分別與 PCA 系統的哪個片段融合，理論上應不影響兩個目的蛋白的相互作用。因此，置換與兩個目的蛋白質融合的片段應得到類似可比的結果。
( 4 ) 無相互作用蛋白質（noninteracting protein) : 如果已知一個蛋白質不和任何一個用于 PCA 測試的目的蛋白有相互作用，理應檢測不到 PCA 反應（圖 15.2A ) ，并且單獨過量表達這個蛋白質也不會對已知的相互作用有競爭影響。
( 5 ) 通過競爭實驗滴定和降低報告蛋白的酶活：報告蛋白的活性應隨著兩個融合蛋白表達比例的變化而改變；而且同時單獨過量表達相互作用蛋白的其中之一應減弱 PCA 反應的活性。然而，應謹記每個融合蛋白相應的可溶性和穩定性、相互作用蛋白質間的親和力對比它們的胞內濃度以及 PCA 的靈敏度都會對 titrate 報告蛋白的活性造成影響。因而可以通過降低融合蛋白的表達水平或整合對照 2 和對照 6 來調節報告蛋白的活性，從而降低互補效率。
( 6 ) 破壞相互作用：可以預測，在形成復合體的一個單體中插入特定的點突變或刪除突變破壞或減弱目的蛋白相互作用力也會影響 PCA 反應。
如果蛋白質工程項目中用于研究的模型性質已經相當清楚，那么只有對照 1、對照 2、對照 4 和對照 6 對于確定實驗的特異性和準確性是必需的。RBD-ras 的互補突變實驗及突變對親和常數 Kd 的影響已有相關報道，基于這些數據我們構建了若干突變，使 RBD-ras 相互作用的 Kd 值降低了三個數量級（圖 15.3 例子）。我們將這些突變體和其他突變體都用于 DHFR-PCA 測試，以確保這項實驗可以在 1 μmol/L 的數量級上檢測到 RBD 與 ras 的相互作用。另外，已發表的降低蛋白質穩定性的突變，如將核心區疏水氨基酸殘基（Val、Leu 或 lle ) 突變成 Ala，可以用于嚴密性測試。
3.2 合成文庫
( 1 ) 為了得到一個無偏倚的文庫，首先要構建一個模板，用終止密碼子替換基因插入區（可變區），同時插入移碼（frame shift ) 和特定的限制性內切核酸酶位點以確保其明確鑒定（見注 1)。
( 2 ) 要得到每個文庫，需要兩個部分重疊（一般 18~20 bp) 的 PCR 產物。例如，對于 PCR 反應 1，使用的一條引物與載體的啟動子區域（起始密碼子上游 120 bp，圖 15.4) 雜交互補，另一條引物與簡并靶標的 5' 段互補。對于 PCR 反應 2，需要一條雙臂引物和一條與 F[ 1，2] ( 可讀框 3' 下游 120 bp 處，圖 15.4) 雜交的引物。通常，PCR 反應程序設置如下：94°C 熱起 1 min；然后，94°C 30s，52°C 30s，72°C 30s ( 見注 2)，共 25 個循環；最后，72°C 延伸 10 min 以確保延伸完全。
( 3 ) PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用 Gelstar 和 Dark reader（見注 3 ) 觀察瓊脂糖凝膠上的 PCR 產物，這里使用的是 400~500 nm 的藍光，此波長對 DNA 沒有損傷。如果得到目的條帶，將剩余的 PCR 產物用于切膠回收。
( 4 ) 使用 QiaexTMII 純化切膠產物（見注 4 )。
( 5 ) 將來源于 PCR 反應 1 和 2 的產物約 300 ng 混合（圖 15.4 和注 5)，加入 0.2 μmol/L 的末端引物（分別與啟動子區和 F [ 1，2 ] 互補）分別與 PCR 反應 1 和 2 的 5' 端和 3' 端退火。PCR 反應 3 程序如下：94°C 熱起 1 min；然后，94°C 20s，52°C 30s，72°C 30s，共 10 個循環；最后，72°C 延伸 10 min 以確保延伸完全（見注 6 )。
( 6 ) 使用合適的限制性內切核酸酶（此例是 SphI 和 XhoI ) 酶切以上得到的 PCR 產物和載體 pQE-32△F [ 1，2 ] ( 見注 7)。
( 7 ) 純化酶切產物同第（4 ) 步。