相互作用克隆實驗

發布時間：2020-08-17 12:09 原文鏈接：相互作用克隆實驗

實驗方法原理

它需要一種編碼誘餌蛋白的基因和用噬菌體表達載體，如 λgt 11 構建的適當的表達文庫。編碼誘餌蛋白的基因常用于在中合成重組融合蛋白。重組融合蛋白使用具放射性的 [32P] 作標記。由于 cAMP 依賴蛋白質激酶（蛋白質激酶 A，PKA）的識別位點被引入重組融合蛋白質，從而可通過 PKA 和 [γ-32P]ATP 使它酶促磷酸化。此標記蛋白質可作為探針篩選源于 λ 噬菌體的 cDNA 表達文庫，這種文庫讀框表達 β-半乳糖苷酶融合蛋白。噬菌體裂解細胞形成噬斑并釋放融合蛋白，融合蛋白吸附到硝酸纖維濾膜上，用過量的非特異性蛋白封閉濾膜來排除非特異性結合，再用放射性標記的誘餌蛋白檢測。

實驗材料 cAMP依賴型蛋白質激酶純化的GST-誘餌蛋白質融合體（帶有 PKA 識別位點）E.coli Y1090 r- 或其他適當的宿主菌

試劑、試劑盒 DTTPKA緩沖液 [γ-32P] ATPZ'-KClSephadex G-50LB培養基MgSO4IPTG頂層瓊脂糖Tris 緩沖鹽溶液（含 Triton X-100）印度墨水HEPES 封閉緩沖液（HBB）結合緩沖液（BB）懸浮培養基（SM）氯仿

儀器、耗材 3 ml 一次性塑料柱／一次性注射器和玻璃棉閃爍計數儀閃爍液臺式離心機硝酸纖維濾膜22-G針頭

實驗步驟

1. 在 25 μl 新鮮制備的 40 mmol/L DTT 中重懸 250 U/μl PKA，并在臨用前置室溫約 10 min。

PKA 可暫時保存在 4℃，但活性只能保持 2~3 天。

2. 制備含以下成分的磷酸化反應的混合液：

1 μl 10 U/μl PKA（從步驟 1 獲得）

3 μl 10 × PKA 緩沖液

5 μl 10 mCi/ml（6000 mCi/mmol）[γ-32P] ATP

1~10 μl（約 1 μg）純化的 GST-誘餌蛋白質融合體

補加 H2O 至 30 μl

于室溫孵育 1 h。

與誘餌蛋白不相連但含有 PKA 識別位點的融合體亦應該表達用作對照來測定觀察到的相互作用是否是特異性針對誘餌蛋白質的。最好同時標記誘餌蛋白和未與誘餌蛋白相連的融合體（在不同的反應中）。

3. 加入 170 μl 冰冷的 Z'-KCl（中止反應）并于冰上保存待用。

4. 將在 Z'-KCl 中平衡好的 Sephadex G-50 倒入 3 ml 一次性塑料柱（或 3 ml 玻璃棉塞的注射器）中，最終床體積約為 3 ml。允許柱中緩沖液流出至柱床頂部的水平。

5. 將所有磷酸化反應物（從步驟 3 獲得）加樣到層析柱中并用 1.5 ml 離心管收集流出液。置第二支試管，加入一份 200 μl Z'-KCl，并收集流出液。再重復 10 次上述的加入和收集步驟，總共收集 12 份 200 μl 流出液。

6. 使用閃爍計數儀測量契侖科夫數以確定含有最高特異活性的流出液，并計算 cpm/μl。

典型的情況是可見到兩個強信號峰：第一個峰在第 5~9 份流出液之間，由標記蛋白質產生。遺棄第二個峰，它由未結合的 ATP 產生的。

7. 可選：用 SDS-PAGE 分析小量（1~2 μl）的 32P 標記的蛋白質探針并作放射自顯影。

典型的情況是可見到兩個強信號帶：一個處在 GST-誘餌蛋白融合體的預計分子質量大小的位置，而另一個處在非融合的 GST（28 kDa）預計分子質量大小的位置。這是因為在融合蛋白中 GST 與誘餌蛋白結合處本身對蛋白酶裂解敏感。在探針中出現標記的 GST 蛋白應該不會干擾篩選；在后續篩選階段應補加標記 GST 的對照實驗。

8. 作系列稀釋，測定噬菌體 cDNA 文庫的滴度。

9. 在含適當選擇性抗生素、10 mmol/L MgSO4 和 0.2% 麥芽糖的 LB 培養基中過夜培養 50 ml E.coli Y1090 r-(或其他合適的宿主菌）。于室溫以 2000 g 離心細菌細胞 10 min，再用 25 ml 10 mmol/L MgSO4 重懸細菌細胞。

10. 于室溫在 10 mmol/L IPTG 中浸泡硝酸纖維素濾膜 15 min，然后空氣干燥。

11. 準備 8 個 1.5 ml 離心管，每管含有 600 Y1090 r-細胞（來源于步驟 9）和約 40000 pfu 噬菌體（來源于步驟 8），并于 37℃ 浮育 15 min。將每管中的內容物倒入 47℃ 含 7 ml 0.7% 頂層瓊脂糖的試管中并迅速倒入 150 mm LB 平板中（如果需要也可是含抗生素的 LB 平板）。于 42℃ 培養平板約 3 h，直至生長出可見的微小噬斑。

12. 將 IPTG 溶液預飽和濾膜鋪在平板上并于 37℃ 繼續培養 6~8 h。于 4℃ 將平板冷卻 15 min（或過夜）。

噬斑形成的過程中不誘導 lacZ 基因啟動子，確保了在噬菌體形成噬斑時不表達任何一種對噬菌體生長有毒的文庫編碼蛋白質。

通常浸透 IPTG 的濾膜孵育 6~8 h，為方便起見，可與浸透 IPTG 的濾膜孵育過夜。

13. 用蘸有印度墨水的 22-G 針頭在每個濾膜刺幾處以標記方向。從平板上移去濾膜并用 TBS-T 于室溫振蕩洗滌 15 min。將濾膜浸泡在 100 ml HBB 中于 4℃ 搖擺 1~4 h（或過夜）。

14. 再將濾膜浸泡在含有 2.5 × 105~5 ×105 cpm/ml 同位素標記的融合蛋白（從步驟 6 制備）的 BB 中于 4℃ 搖擺過夜。

所有 8 張濾膜可置于一個 150 mm 平皿中并浸泡在 30~40 ml 探針溶液中。用石蠟膜將平皿封口，然后放在一個有機玻璃箱中屏蔽起來。另外，也可將濾膜和溶液放在封口袋中。探針溶液可于 4℃ 保存并可反復用于次級和三級篩選。

15. 于室溫在 100 ml BB 中振蕩洗滌濾膜 3 次，每次 10 min。空氣干燥后壓片。

16. 使用巴斯德吸管較大的一端，在陽性克隆的位置插入取出瓊脂糖塊。將其置于一個 1.5 ml 微量離心管中，然后加入 1 ml SM 和一滴氯仿。經系列稀釋測定滴度并進行連續篩選以期獲得純化克隆。

瓊脂糖塊可于 4℃ 保存數月。因此，如果在初級篩選中確認了許多假定陽性克隆，視需要可將它們全部保存起來留待以后分析。

接下來的篩選在 100 mm LB 平板上進行，次級篩選用約 2000 pfu/平板，而三級篩選用約 300~500 pfu/平板。在獲得均一性克隆之前（通常在三級篩選期間），應進行對照實驗排除可能與探針 GST 融合部分相互作用的克隆。做該實驗時可將濾膜剪成兩半，用與標記的 GST-目的蛋白融合體探測其中一半，而另一半用標記的 GST 或未標記的對照 GST 融合蛋白質檢測。

注意事項

在本方案中使用了放射性標記物，應小心操作并采用適當的屏蔽保護。