肽質量檢索實驗

實驗方法原理

實驗材料 蛋白樣品

儀器、耗材 質譜儀

實驗步驟

鑒定數據庫中已有序列的蛋白質的算法基于以下一些理念：

(1) 肽段是由切點專一的試劑水解蛋白質產生的，通常用已知切點專一的蛋白酶。

(2) 這些肽段的質量由 MALDI-MS 或 ESI-MS 精確測定。

(3) 計符蛋白序列數據庫中的每一序列被實驗中所用水解試劑水解后產生的理論肽段的質量。

(4) 用試驗得到的肽質量與數據庫中的肽質量計算值相匹配，計算得分或排序值。

這種檢索途徑有一個明顯的限制，就是被鑒定的蛋白質必須已經存在于序列數據庫（翻譯的核酸序列或蛋白序列數據庫）。這一手段非常適用那些基因特性非常清楚的物種，特別是全基因組已知的物種（例如見 TIGR 數據庫， http,//www. tigr. org/tdb), 亦用于那些已經建立詳盡的蛋白質或 cDNA 序列數據庫的物種。肽質量檢索鑒定蛋白質方法的依據是實驗中獲得的蛋白質的多個肽段的質量數據與同蛋白質肽段質量計算值之間的相關性。因此，這一技術既不適用于檢索表達序列懷鑒數據庫 (EST) 翻譯序列，也不適用于鑒定 2個以上的蛋白混合物。但是，對某些蛋內質可進行種屬間鑒定，已經有了為這一特殊目的而編寫的程序, EST 僅代表蛋白編碼序列的一部分，其長度不足以產生供肽質量鑒定實驗所需的足夠的肽數目。如果水解蛋白質混合物，只產生其中部分特異肽質量的蛋白質的鑒定就不明顯。 但如果每一個觀察到的肽段都能與序列數據庫中的某一蛋白精確相關，混合物中蛋白質的鑒定仍可行。

方法是從測得的肽質量中去掉與已被鑒定的蛋白質相關的所有朕段，用剩余的質量數檢索數據庫，將這一步驟重復循環進行。但是．，由于下面將要提到的一些原因，所有檢測到的肽質量都與蛋白質的序列相符的情況很少發生，這不僅使混合物中各組分的鑒定變得復雜，還使單一的純蛋白質的鑒定也復雜化，因此，了解那些未匹配的肽質量數的性質非常重要。下面將講述與匹配正確與否有關的這些表觀偽質量 (spurious masses) 存在的可能原因

(1) 蛋白質被正確鑒定，但是由于翻譯后修飾或人為修飾及翻譯后加工（如 N 或 C未端加工）產生了另外的質量 盡管某些質量的差異可能與這些修飾情況相符，但除非經實驗證明，否則僅僅是假設。

(2) 蛋白質被正確鑒定，但存在非特異性的蛋白水解，或有雜蛋白酶存在。通過排除酶切位點專一的假設，確定候選蛋白是否會產生具有那些質量數的肽段．這樣可以接受這種可能性。

(3) 蛋白質被正確鑒定，但有部分雜質蛋日質混在其中，如 2-DE 膠上的蛋白且可能由多個蛋白質組成。如果有足夠多的未匹配肽質量數，就可以用這些數據單獨進行肽質量檢索，以證實存在另外的蛋白質。當然要做酶自切的對照實驗，以鑒別所有的酶自切產物。

(4) 被鑒定的蛋白質或許是數據庫中已登錄蛋白的同源序列，或者是其序列的剪切變異體。某些檢索程序允許實現跨種間檢索，如果能得到另外確實的數據，這一方法還是很有用的。因為從基因特征不清楚的種屬得到的蛋白質也許可以什基因特征清楚的種屬的蛋白序列庫中得到匹配鑒定。

(5) 蛋白質的鑒定結果是假陽性。如果沒有其他數據，持別是實驗數據的質量數精確度不高時，這一糟糕的結果很難被證實或證偽。如果所用檢索程序是用鑒定結果的祖分值排序，而所得檢索結果得分值又比較低時 該結果的證實就更加困難了，某個例子中，通過比較檢索結果中排序第一和第二位（及后面）的得分值之萍，得到進一步確認為此蛋白壓也可能在蛋白數據庫中不存在。