實驗方法原理
乳酸脫氫酶( lactate dehydrogenase, 簡稱為LDH) EC ( 1 ,1 , 1 . 2) 存在于一切有糖酵解作用的細胞中, 在NAD+存在下催化乳酸脫氫形成丙酮酸或使丙酮酸還原成乳酸。其酶蛋白是由四個亞基組成的四聚體, 亞基有心臟型( H 型) 及肌肉型( M型) 兩種。根據酶蛋白四聚體中H 型和M 型亞基比例的差別,可將LDH 同工酶分為五種, 即LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。亞基分子量相似, 為35000左右, 但帶電荷情況不同,因此在電泳時有不同的電泳速度。本實驗系用瓊脂糖凝膠作支持介質, 在pH8 . 6 的巴比妥緩沖液中電泳, 將LDH 同工酶分離。以乳酸為底物, 在氧化型輔酶I 存在時, LDH 可使乳酸脫氫生成丙酮酸, 使NAD+ 還原成NADH2 , NADH2 又將氫傳遞給吩嗪二甲酯硫酸鹽( PMS ) ,PMS 再將氫傳給氯化硝基四唑藍(NBT ) , 使其還原為藍紫色化合物。因此, 有LDH 活性的區帶即著藍紫色。
實驗材料 乳酸脫氫酶
試劑、試劑盒 瓊脂糖巴比妥緩沖液蒸餾水乳酸鈉溶液氯化硝基四唑藍水溶液氧化型輔酶Ⅰ吩嗪二甲酯硫酸鹽醋酸溶液尿素水溶液
儀器、耗材 電泳槽電泳儀恒溫培養箱冰箱
實驗步驟
1 . 凝膠板的制作: 將電泳洗凈、干燥, 兩邊用膠帶封口,選好梳子并裝好, 調節水平, 澆已熔化好的0 . 7%瓊脂糖凝膠適量, 冷至凝固, 然后移至4 ℃冰箱中放置30～50 min 后使用。
2 . 點樣及電泳: 將電泳緩沖液加到槽中剛好蓋上凝膠, 用微量取樣器加20 μl 血清樣品(樣品中或加入溴酚藍指示劑) , 按4～5 mA/ cm 膠寬調節電流, 電泳大約40～50 min , 直至血清白蛋白( 或溴酚藍指示劑) 距膠終點1～2 cm 時停止電泳( 如果室溫比較高就在冰箱中電泳)。
3 . 顯色: 將電泳后的凝膠放于帶蓋培養皿中, 用毛細滴管加顯色劑均勻鋪凝膠上一薄層, 然后平放于37 ℃ 恒溫培養箱中避光保溫60 min , 使同工酶各區帶充分顯色。
4 . 固定: 將顯色后的凝膠板放入10%冰乙酸水溶液中固定10 min , 傾去固定液, 蒸餾水漂洗2次, 洗去多余的顯色液。
5 . 定量分析: 漂洗后的膠板, 用刀割下各區帶, 分別移入已放有3 ml 25%尿素水溶液的試管內, 混合, 置沸水中10 min ,待凝膠全部熔化后, 移至37 ℃水浴中冷卻10 min 后比色。722分光光度計, 波長560 nm, 蒸餾水調零, 記錄各區帶光密度值。計算各區帶的百分含量。計算方法為: 各區帶光密度值除以各區帶光密度之和乘以100%。
注意事項
1. 在LDH 同工酶顯色后, 往往在LDH1 前沿有一塊桃紅色的非特異性顯色區域, 這不是LDH1 的組成部分, 定量時應去掉。
2. 溶血標本對結果有明顯影響, 不能采用。
3. 本法也適用于各種體液LDH 同工酶測定。