對于多肽、蛋白質或核酸，通常采用的共價吸附是, 通過胺反應將配基上的氨基吸附在樹脂表面。溴化氰活化表面與伯胺發生反應形成亞胺碳酸鹽是最常見的胺反應吸附。
最典型的伯胺是賴氨酸側鏈（Hermanson,1992;PorathetaU1%7)(詳見第 28 章）。這種活化形式的優點在于可以使用商業化的預活化樹脂，與蛋白質的偶聯效率幾近 100%。
雖然過去一直普遍使用這種方法，但也存在許多缺點:①連接導致配基從樹脂上脫落;②配基直接吸附到介質表面, 無間隔;③由于溴化氰具有毒性，需要增加安全防范。而且，可能需要通過交聯限制這種固定方式存在的缺陷 (KorpelaandHinkkanen，1976;KowalandParsons，1980)。
酰胺鍵的共價吸附是一種替代溴化氰活化作用的方法，可以通過活化的羧基表面 (如羥基琥珀酯) 形成，或者用偶聯試劑對羧基進行原位活化，如沖乙基 N-(3-二甲氨基) 碳二亞胺 (EDCKWilcheketal.，1984;1994)。另一種可選擇的較穩定的方法是仲胺化連接。伯胺 (賴氨酸或 N 端) 和醛活化表面形成希夫堿 (Schiff 堿）中間體，后者經過還原烷基化形成仲胺。還原烷基化的吸附方法偶聯條件溫和，據報道與其他方法相比可以保留更多的酶活性，因此這種機制廣泛應用于將酶固定于碳水化合物表面 (瓊脂糖或纖維素）（Hermans o n，1992)~
胺反應連接也是小分子配基與介質表面吸附的常用方法。首要的是預先設計配基中用于吸附的胺基。很多可以用于胺固定的化學試劑也適用于硫氫基 (或硫醇基) 活化固定。在概念上, 巰基固定與胺基固定相同，但前者依賴于半胱氨酸與活性表面的反應。對于巰基特異性固定，兩個最突出的策略是通過鹵代乙烷 (碘或溴) 和馬來酰亞胺活化介質表面 (Malliketal.,2007)。巰基連接反應是可逆的，這也是其優點。用還原劑如 DTT 或 TCEP 處理, 可去除表面的二硫鍵連接 (Brniaetal.，1993)。
可以通過前面介紹的方法將抗體或糖蛋白固定到表面，也可以采用修飾碳水化合物的方式，這種方法可能更具有定向性（Oatesetal.，1998;VijayendranandLeckband，2001)。通過碳水化合物固定，需要采用溫和氧化物 (如髙碘酸鹽) 使碳水化合物的糖殘基發生成醛反應。氧化形成的醛用于將蛋白質或抗體固定至酰肼化表面。這種方法通常用于抗體、糖蛋白、糖聚合物和核糖核酸 (O’shannessyandWilchek,1 卯 0)。
在大多數情況下，采用前面討論的活性基團中的一種進行配基吸附就足夠了。但某些情況下，需要增加連接物與介質表面間隔的距離。一種方法是用間隔物對目的配基進行正交修飾，另一種活性集團會優先識別吸附在表面上的正交標簽。這需要用合適的活性基團修飾表面和配基。目前常見的所謂「點擊化學」(clickchemistry) 就是這種方法的具體體現，即銅 (I) 催化的疊氮末端炔烴化的 1，3 肩極環加成反應形成 1，2，3-三唑 (0^-dranetal.，2009;GauchetetaI.,2006)。這種方法的優點是，化學作用溫和，具有獨一無二的選擇性，并且活性基團可以在配基和介質表面之間隨意轉換。由于反應本身需要催化，因此與常用的硫醇和胺標記后活性基團相比，反應基團本身更加穩定。
親和純化程序從適當處理樣品和介質開始，接著是靶標的選擇性結合 (捕獲)，清洗除去非特異性背景，最后洗脫結合靶標。親和純化的成功取決于一些值得注意的因素，包括樹脂上配基的數量和配基的可用程度、相互作用的強度以及固定蛋白質的完整性等。通常優化結合和清洗條件是為了將靶標及固定配基之間的反應最大化。然后從根本上轉換成減弱相互作用的條件, 釋放靶標。建議進行小規模實驗，以選擇最佳的純化條件。下面章節簡要概括一些常見的應用問題和影響親和純化的原因。
制備純化樣品時, 選擇的條件應能保持目的靶標適宜倍數和功能。強烈建議除去不溶物、降低黏度，因為這些因素都可能堵塞層析柱, 降低流速，增加反壓。
一些蛋白質在高濃度時有聚合傾向，導致表觀分子質量增加，降低擴散速率，減少親和介質的捕獲。此時，為了降低聚合, 增強對蛋白質的捕獲和回收能力, 需要將樣品或細胞裂解液稀釋至較大體積。但是，如果樣品太稀, 結合率和捕捉效率會降低，特別是對于低親和力的結合物。
結合效率與蛋白質-配基間相互作用的強度和動力學相關，受到相互作用的特性、應用靶標的濃度、固定配基量及結合流速影響。式 (26.1) 為結合過程的簡化，假設摩爾比為 I:1 時，Ka 為關聯平衡常數，[L] 為配基濃度，[T] 為靶蛋白濃度，[LT] 為復合物濃度。
Ka=[LT]/([L]X[T]), 也可以表示為九/々 dA 為二階聯合速率常數，取決于 L 和 T 兩者的濃度，&表示一階解離常數，不依賴于配基濃度。Ka 為總靶標與結合靶標的比值，Ka 越高，吸附率越高，結合效率越髙。通常情況下，介質上配基的濃度為 KT4~10_2m o l/L。
艮值為 IO4~IO6mol/L 時, 可以實現有效結合。
通常在環境壓力下，使樣品緩慢流過用親和介質裝填的層析柱，可將其親和固定至固相載體。一般來說，較高流速會降低結合效率, 特別是在配基與蛋白質間相互作用較弱或層析柱中的物質轉移速率很慢時。結合程序也可以以直接混合的形式進行，將樹脂和樣品持續混合。尤其在處理大體積樣品時，通常直接混合可以節省時間，有效地促進靶標和固定配基間的接觸。但是，直接混合也會增加非特異性結合。在純化過程中，優化樹脂用量是很好的解決方法。在結合過程中，多余的樹脂會增加非特異性結合，而且樹脂的再吸附性會降低 IE 標回收率，因此要優選使結合靶標達到飽和的樹脂用量。除非在某些特殊情況下才需要降低靶標回收率。
接下來的程序是洗滌。通過清洗去除非特異性結合的蛋白質。例如，通過增加鹽濃度 (0.1~0■5mol/L) 或改變 pH 降低離子相互作用; 通過降低鹽濃度, 改變 pH, 或加人表面活性劑 (如 TritonX-00) 去除疏水相互作用。也可用少量的競爭物去除與配基結合較弱的污染物。為了最大程度去除雜質，最小限度損失靶標, 應慎重決定清洗緩沖液的體積 (如 5~10 個柱體積) 和流速。
實質上，從樹脂上洗脫結合靶標是結合的可逆過程。因此優化條件降低 Ka，即可削弱靶標和配基之間的相互作用。洗脫條件不應使靶蛋白質變性, 除非這些條件與下游程序兼容。
有兩種不同類型的洗脫方法，即特異性洗脫和非特異性洗脫。特異性洗脫過程中, 介質或競爭配基或競爭靶標，通過這種形式攻擊蛋白質-配基復合物，繼而將靶蛋白釋放至溶液中。用于洗脫的競爭介質的濃度和量 (體積) 依賴于其親和力，這種親和力與固定復合物的親和力相關。與親和力強的添加物相比，競爭介質的結合越弱越需要更高的濃度和更大的體積。對于弱的競爭介質，比配基高 10 倍是較好的濃度起點。特異性洗脫通常是溫和的，更可能保留蛋白質的活性。這種方法的缺點在于，洗脫慢，洗脫峰寬，需要從回收的蛋白質中去除競爭介質。對于非特異性洗脫，應控制溶劑條件降低關聯速率常量 [式 (26.1)]，該常量應趨近于零，同時增加解離速率常量，進而削弱整體親和力 (Ka), 導致復合物解離。根據配基與蛋白質之間的相互作用機制優化洗脫條件, 如增加鹽的濃度、降低離子相互作用或通過改變 pH 來改變質子化/離子化狀態，從而調節氫鍵強度、疏水相互作用及靜電相互作用。從固定的 ProteinA 或 ProteinG 上洗脫抗體就是一個改變 pH 的例子。然而 ProteinA/ProteinG 與抗體的親和力非常強 [Ka 為 lOVCmol/L)-1 左右)], 需要不同洗脫條件組合達到最大程度的抗體釋放。通常, 親和作用需要靶蛋白質正確地三維折疊，因此離液劑或影響蛋白質折疊的試劑可用于洗脫目標蛋白質，但是，必須注意保證耙標的正確折疊在洗脫后迅速恢復天然條件。當親和力弱時，高濃度靶分子結合后，通過稀釋以解離、洗脫復合物。這種方法即等度洗脫 (isocraticelution)。