實驗材料 cDNA
試劑、試劑盒 BHI氯霉素NaOHSSC氯仿異戊醇TESSDSmRNA甲硫氨酸乙醇乙酸鈉免疫沉淀緩沖液
儀器、耗材 轉子硝酸纖維濾膜離心管微量多孔洗滌儀
實驗步驟
1. 往微量滴定板的每孔中加入250 μl 含適當抗生素的選擇性BHI培養液，并分別接種獨立的cDNA克隆，37℃溫育過夜。
2. 在250 ml 燒瓶中加入50 ml BHI/抗生素培養液，以10個克隆過夜培養液為一組， 從每個微孔中取100 μl 培養液，混合后接種到燒瓶中。
3. 37℃培養至A590=0.7，然后加入氯霉素繼續于37℃溫育過夜；對每組10個過夜的克隆重復培養。
4. 2 000 g 4℃離心10 min，制備質粒DNA。
5. 將制得的約50 μg 質粒DNA溶于1.5 ml TE緩沖液中，移入15 ml無菌、帶蓋的玻璃培養管中。
6. 沸水浴10 min立即加入1.5 ml 1 mol/l NaOH，室溫放置10 min。
7. 加 9 ml 中和液，混勻后置于冰浴，檢測pH只值應在6.5~7.5之間。
8. 將0.45 μm 孔徑的硝酸纖維素濾膜放在一個連于真空泵的多孔濾器上。
9. 以1 ml/min 的速率加入第4步得到的變性DNA液，待所有液體被吸干后繼續抽吸3 min。
10. 取出濾膜用50 ml 6×SSC洗滌，然后于80℃真空烤箱中烤膜2 h。
11. 用無菌的單孔打孔器在濾膜上打出直徑為5 mm 的圓形小塊濾膜，分別用圓珠筆作好標記。
12. 將盛于無菌帶蓋的塑料管的含10~50 μg poly（A）+ RNA的0.3 ml 雜交液在70℃預熱10 min。
13. 然后將10片小濾膜放入雜交液中，在50℃溫育2 h。
14. 將小濾膜轉移到50 ml 的試管（每管最多可裝20片膜）中，每次用225 ml TES/0.5%SDS冼液于65℃旋轉振蕩洗滌30 s，共10次，吸去上請。
15. 然后每次用25 ml TES液干65℃洗膜，共2次。
16. 將每片小濾膜分別轉移到無菌、硅化的1.5 ml 微量離心管中，每管加入0.3 ml 水、2 μl 10 mg/ml 的酵母tRNA。
17. 置沸水浴中變性60 s，立即置干冰或冷乙醇中速凍。 接著在室溫下解凍。
18. 用無菌針挑去濾膜，往每個微量離心管中加入150 μl 飽和酚和150 氯仿/異戊醇，混勻，離心后將水相轉移至無菌的微量離心管中。
19. 加入30 μl 3 mol/l 乙酸鈉和2 倍體積的無水乙醇，離心沉淀核酸15 min，用0.5 ml 乙醇洗滌一次后凍干。
20. 將此雜交選擇的RNA重懸于10 μl 水中。
21. 取5 μl 雜交選擇的RNA，加入10 μl 翻譯反應混合物，其中含標記的甲硫氨酸， 30℃溫育60 min。
22. 加入15 μl 免疫沉淀緩沖液和1 μl 未經免疫的血清，室溫下溫育10 min。
23. 加入40 μl 蛋白質A-Sepharose懸液，在室溫靜置30 min、離心2 min 后將上清移至另一個新的微量離心管中。
24. 加入1 μl 針對相關基因產物的多克隆抗體或單克隆抗體，于室溫下溫育10 min。
25. 加入40 μl 蛋白質懸液，于室溫反應30 min，離心棄上滑。
26. 依次用1 ml 免疫沉淀緩沖液、1 ml 高鹽免疫沉淀緩沖液和1 ml 水冼滌蛋白A-Sepharose微珠。
27. 用20 μl 2×SDS樣品緩沖液重懸沉淀，沸水浴10 min。
28. 將吸附在蛋白A-Sepharose微珠上的翻譯產物洗下來，離心后等分成15~20 ml 的小份進行變性SDS-PAGE電泳。
29. 干膠并進行放射自顯影曝光。
