| 實驗方法原理 | 在 ESI源中，含有被分析樣品（多肽／蛋白質）的溶液流經一個細細的進樣針，針頭上加高電壓(+ 1000-5000V) 用來產生正離子，見圖 5.2a。高電壓導致樣品液流分散為呈噴霧狀的帶高電荷的微小液滴，質譜儀入口端的有孔平板上加有+ 100--1000V的低電壓，引導離子通過入口 （orifice）, 這一入口是離子源和質譜儀的連接處，離子源處于大氣壓環境，質譜儀處于真空系統。 當液滴從針尖通往入口時，在定向惰性氣體流（有時加熱）的作用下溶劑蒸發，使液滴縮小, 液滴電荷密度增加，最終導致液滴爆裂，離子從液相中桿放出來進入氣相。離子通過入口后，在一個只加有射頻場 (radio frequency, RF) 的四極桿控制下進入質量分析器，可以是四極桿、四極桿－飛行時間、或離于阱質量分析器, ESI 產生的多肽離子的特征是帶多電荷，電荷數與肽分子中可電離的集團數目有關。 如果用 ESI-MS 正離子模式分析胰酶酶切肽段，大多數肽段都會帶至少兩個電荷、一個在 N 末端的 NH2 基團上, 另一個在胰酶酶切位點，肽段C未端堿性氨基酸的側鏈上，
|
|---|---|
| 實驗材料 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 三級四極質譜儀由三套四極桿組成（圖S.2b)- 四極桿濾質器既可以傳送混合物中所有的離子（以射頻 RF-only 方式工作），又可以充當質量過濾器，只允許特定質荷比的離子通過。四極桿由 4個平行的圓棒構成，相向的一對圓棒上施加電極相反的直流和交流電壓。當離子漂移通過四極桿圓棒的中間區域時，改變四極桿上施加的電壓，使具有特定 m/z質荷比的離子才能通過，所有其他質荷比的離子改變了線性飛行烙徑，從分析器中消失，如果四極桿上施加的電壓連續變化（掃描），由通道－電子倍增器記錄通過濾質器的離子數目, 并與特定的離子m/z質荷比建立函數關系，就得到一張質譜圖。四級質量分析器通常可分析的質量范圍是2500 - 4000u, 因為記錄的是m/z，而不是多肽質量本身，而且 ESI 通常產生帶多電荷的肽離子，所以使用 ESI 源的四極質量分析器能用來分析遠遠超出其質量分析范圍的蛋白質。在三級四極質譜中，第一級 Q1 和第三級 Q3 四極桿是質量過濾器，第二級四極桿Q2 僅施加射頻電壓，充片產生碎片離子的碰撞室，從 Q1傳送來的肽離子在碰撞室內經重的惰性氣體如Ar和 N2的碰撞誘導，產生正離子，這一過程種為碰撞誘導解離(collision-induced dissociation, CID) 。
二級四極質譜儀有 5 種工作模式 (1) MS 模式 這種模式用于分析未解離的離子質量。掃描 QI, Q2 中未引入裂解氣體， Q3 為射頻電場模式 也可以使 Q1處于射頻模式，掃描 Q3 電場實現質量測定。 (2) MS/MS模式（也稱為產物離子掃描法， product ion scan) 在一個給定的時間點， Q1 設定為僅傳輸某一選定質荷比的離子，此離子進入 Q2 后，經碰撞誘導解離，產生的碎片離子通過掃描 Q3 進行檢測。這樣得到與 Q1 選擇的初始肽段離子相關的碎片離子質譜圖。Q1 選擇母離子，在 Q2 內進行 CID, Q3 分析碎片離子, 這一分析過程不斷循環，用以選擇分析不同質量的肽段離子。實際上，某些儀器如 TSQ 7000 (Finnigan, MAT, San Jose, CA) 可以設定程序自動在 MS 和 MS/MS 模式間切換，將 MS 檢測到的離子進行 CID 分析，并記錄碎片離子的質譜圖，整個過程不需要用戶介入。 這過程稱為數據依賴的 CID (data-dependent CID) 產物離子扣描法可用來測定肽段的氨基酸序列。 (3) 中性丟失掃描模式 (neutral loss scan mode) 此模式中 Q1 和 Q3 的電壓同步打描，但保待一個特定m/z值的電壓差 (offset)。 Q2 是碰撞室， Q1 和 Q3 的電壓差值與 Q2 內碰撞消除的一個特定中性分子的質量一致。因此，在離子混合物中，只有碰撞裂解后能丟失這一特定基團的離子才會被 Q3 傳輸到檢測器，例如，在磷酸肽與非磷酸肽混合物中，通過對 49 m/z的 H3PO4 的中性丟失掃描，可以檢測出磷酸肽的雙電荷峰。在離子被傳送到檢測器時，已經知道 Q1 和 Q3 上各自施加的特定電壓，所以可以確定發生中性丟失的肽段質量。 (4) 前體離子（母離子）掃描 (precursor/parent ion scanning) 此模式中掃描 Q1電壓， Q3 設置為只傳輸某一特定質荷比離子， Q2 為碰撞室。與 “中性丟失掃描相似，前體離子掃描檢測離子混合物巾在 Q2 碰撞中丟失特定基團的離子。與中件丟失扣描個同的是 前體離子掃描模式直接檢測斷裂的基團（報告離子，reporter ion) 。檢測器檢測到報告離子時，已知 Q1 的電壓，所以可以確定產生這一特定碎片的前體離子的質量。因此前體離子掃描模式被用來檢測肽混合物中某些含有特定結構特征的肽段。 (5) 源內 CID (in-source CID) 裂解發生在ESI源內由大氣壓氣體碰撞產生的高壓區內，可以選擇碰撞條件使肽鏈骨架斷裂 或使一些相對不穩定的基團如磷酸基閉選擇性斷裂。所帶電荷數大于1的肽段離子更容易斷裂，因為在這些離子上分配的動能遠大于僅僅將這些離子聚焦到 Q1 分析器所需的動能。 這一方法提供了在三級四衱質譜儀中實現 MS/MS/MS 分析的機會及在單級四極質譜儀中實現 MS/MS 分析的機會以上任一種掃描類型都適用于源內 ClD 產生的離子。為了鑒定蛋白及對肽段從頭測序，儀器通常以 MS/MS 模式運行。對選擇離子施加的碰撞能量可以通過改變碰撞氣體的壓力而變化，如果時間允許，可以對裂解過程實現很好的控制。在數據依賴操作模式中，質譜儀由程序控制，對 MS 模式檢測到的超過一預先設定的離子流闕值的離子自動進行碰撞誘導解離，碰撞能量勻速變化, 以期在不同碰撞能量中得到的譜圖中全少得到一張最佳裂解碎片譜。但是，當樣品量極少，樣品溶液通過微量或鈉噴 (nano-spray) 裝置引入源內，且樣品未脫鹽時，得所譜圖的化學背景和雜質峰占據主導地位 。因此，為在這樣的混合物中找肽段離子，質譜儀可以前體離子掃描模式運行，將 Q3 分析器設定力 86m/z，即亮氨酸 Leu 和異亮氨敗 Ile 的亞氨離子 (immonium ion) 質量，通常在許多肽段序列中都存在這兩種氨基酸 |
