實驗材料 細胞
試劑、試劑盒 培養液Hanks胰蛋白酶EDTA膠原酶
儀器、耗材 培養瓶離心管
實驗步驟
一、成纖維細胞排除法
1. 機械刮除法
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲），或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。
刮除程序為
（1）標記
鏡下觀察，用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；
（2）刮除
棄掉培養液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間；
（3）用Hanks液沖洗—兩次，洗除被刮掉的細胞；
（4）注入培養液繼續培養，如發現仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止。
2. 反復貼壁法
根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，井結合使用不加血清的營養液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞相互分離，操作方法與傳代相同。
（1）待細胞生長達一定數量后，倒出舊培養液，用胰酶消化后，Hanks沖洗2 次，加入不含血清的培養液，吹打制成細胞懸液；
（2）取編號為A、B、C三個培養瓶；首先把懸液接種入A培養瓶中，置溫箱中靜止培養5~20 分鐘后，輕輕傾斜培養瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液，再接種入B培養瓶中后；向A瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養；
（3）培養B 瓶中細胞5~20 分鐘后，按處理A的方法，把培養液注入C培養瓶中，再向B瓶中補加完全培養基。
當三個瓶內都含有培養液后，均在溫箱中繼續培養。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次，直至癌細胞純化為止。
3. 消化排除法
此法曾用于乳癌細胞的培養，具體程序是
（1）先是用0.5 %胰蛋白酶和0.02 %EDTA（1：1）混合液漂洗培養細胞一次，然后再換成新的混合液繼續消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養瓶，到半數細胞脫落下來后，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養液置溫箱中培養；向原瓶內也補加新的培養液繼續培養。用此法處理后，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落，經過幾次反復處理，可能把成纖維細胞除凈。
4. 膠原酶消化法
本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。
（1）可用0.5 mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視維細胞被除掉后，即終止消化；
（2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養液，繼續培養，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復。
5. 其它方法
有人發現聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025~1.085的密度梯度離心液，加入細胞懸液后，在23 ℃中800 g離心10 分鐘。在比重1.025~1.050層為成纖維細胞，在比重1.065~1.085 層為上皮細胞，再經過分離進行培養。最近也有人應用特殊化學物如SOD抑制成纖維細胞生長的方法。
選用上述任何一種方法，都需進行試驗，取得必要經驗，找出適合的條件，才能獲得好的效果。
其他
一、取材
人腫瘤細胞來自外科手術或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養材料。取材后宜盡快進行培養，如因故不能立即培養，可貯存于4 ℃中，但不宜超過24 小時。
二、培養基
腫瘤細胞對培養基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的RPMI 1640、DMEM、Mc-Coy5A等培養基等皆可用于腫瘤細胞培養。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低，正常細胞培養不加血清不能生長，腫瘤細胞在低血清培養基中也能生長。腫瘤細胞對培養環境適應性較大，是因腫瘤細胞有自泌（Autocrine）性產生促生長物質之故。但這并不說明腫瘤組織完全不需要這些成分。按不同細胞需要不同的生長因子；腫瘤細胞與正常細胞之間、腫瘤細與腫瘤細胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數腫瘤細胞培養中仍需要生長因子，有的還需特異性生長因子（如乳腺癌細胞等）。總之培養腫瘤細胞仍需加血清和相關生長因子培養更易成功。
三、成纖維細胞的排除
成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養中的關鍵。排除成纖維細胞有多種方法。
