脂筏的分離和應用（二）

附 加 材 料

在 S D S 中的溶解

3a 用 100ul 沉淀物裂解液重懸 Triton X -IOO的裂解沉淀。使混合物通過帶22 G 針頭的I m l 注 射 器（以剪切D N A ) 至均一。用 I m l 包 含 1 % Triton X -100的 冰 冷 T N E / P緩沖液進行稀釋， 4°C ，最大速度離心 2 min，保留上清，棄去剩余的不溶性物質。

4a. 為 了 進 行 2 個組分的比較，用 2 0 % 的 S D S 儲 存 液 將 初 始 的 Triton X -100 上清液(步驟 2 ) 調整至終濃度 0.1% S D S 。用 免 疫 共 沉 淀（單 元 12. 2)、 S D S - P A G E (單

元 12. 3 ) 和 免 疫 印 跡（單 元 12. 5 ) 對等量的 2 個組分進行分析。

在 辛 基 葡 糖 苷 中 的 溶 解

3b. 用 I m l 含 有 60 mmo l /L 辛 基 葡 糖苷的冰冷的 T N E /P 緩 沖 液 于 冰 上 重 懸 Triton X -100 裂解沉淀 20 min，以便溶解 D R M 蛋白。渦旋混勻， 4°C ，最高速 度 離 心 2 min，保留上清液并棄去沉淀。

4b 通過免疫沉淀（單 元 12. 2)、 S D S - P A G E (單元 12. 3 ) 和 免 疫 印 跡（單 元 12. 5 ) 等方法，對等量的該組分及原始的 Triton X -100 裂 解 上 清（步 驟 2 ) 進行分析。

輔 助 方 案 1 脈沖追蹤方法分析去污劑抗性的膜蛋白

附 加 材 料

輔 助 方 案 2 通過放射性標記檢測去污劑抗性的膜蛋白的全部組分

附 加 材 料

P B S ，無菌

無甲硫氨酸、包含透析血清的培養基（透析血清方法見附錄 1 ; 用量取決于細胞類型）

[35S] 甲硫氨酸

1 . 在 I O c m 組織培養皿里接種貼壁細胞。如果有必要，將待測細胞接種于兩個培養皿里 ，但是只對其中一個培養皿進行標記（對于非貼壁細胞，接 種 5 X 1 0 6 個細胞，離

輔 助 方 案 3 定 量 高 效 薄 層 色 譜 法（HP-TLC) 進 行 DRM 脂質分析

材 料

甲醇

氯仿

I : 1 和 2 : I (V /V ) 氯仿/ 甲醇

溶 劑 A : 30 : 60 : 8 (V /V A O 氯仿/甲醇/水

硅 焼 化 試 劑（Sigmacote， Sigma)

D E A E 葡 聚 糖 凝 膠（Sephadex) 混 懸 物（見輔助方案 4)

溶 劑 B : 30 : 60 : 8 (V 7V7 V ) 氯仿/甲醇/0? 8mol/L 乙酸鈉

8 : 4 : 3 氯仿/甲醇/0. lmol/L 氯化鈉

0.lmol/L 氯化鈉

溶 劑 C : 3 : 48 : 47 (W V /V ) 氯仿/ 甲醇/0.lmol/L 氯化鈉

溶 劑 D : 3 : 48 : 47 (V /V /V ) 氯仿/ 甲醇/水

氮氣

反 相 C 1 8 柱（見輔助方案 5)

中性脂質標準品

酸性脂質標準品

乙酸

甲酸

己烷

異丙醚

脂類顯影試劑

S W 2 8 轉 子 和 超 速 離 心 管（Beckman)

帶 Teflon 內襯蓋子的 15m l 玻璃管

大 功 率（Laboratory Supplies，型 號 G S P 1T ) 或標準浴槽超聲破碎儀

24m m Whatman G F /C 玻璃纖維濾器

過濾設備：玻璃微量分析過濾裝置（Fisher) ，或以 橡 膠 墊 圈 插 入 125m l 側臂燒瓶的 24m m Buchner 漏斗

帶磨口玻璃瓶頸的 125m l 平底燒瓶和管子

旋轉蒸發器

玻璃棉

一 次 性 IO m l 寬口玻璃移液管

玻璃棒

IO m l 硅烷化移液管

5m l 帶 T e f lo n 內襯蓋子的錐形玻璃管

帶單孔瓶塞的 125m l 側臂燒瓶

無熒光指示劑的 1 0 c m X 2 0 c m 髙 效 薄 層 色 譜（H P -T L C ) 板（Merck)

帶玻璃蓋的薄層色譜缸

預 熱 至 l〇〇°C 、 110°C 、 180°C 的烤箱

改 良 的 IOjL d H a m ilton 注射器：帶有斜切邊緣的注射器，可將上樣角度減少一半，有利于少量滴劑的上樣

帶磨口玻璃塞的 IOOm l 刻度量筒

剪成色譜缸大小的吸水紙

有冷卻裝置的吹風機

0.5 ?I c m 厚錯塊

光密度計

注 ：所有接觸 D E A E 葡聚糖凝膠的玻璃制品使用前均要硅烷化處理。玻璃棉裝好后 ，把玻璃棉和柱子一同進行硅烷化處理。

1 . 準 備 1 0 瓶 I O c m 培養皿貼壁細胞的裂解產物（見基本方案，步 驟 Ia?4a) 或 者 2 XIO8 個的非貼壁細胞的裂解產物（見基本方案，步 驟 Ic?4c)。

2 . 利用蔗糖梯度浮選法制備 D R M (見基本方案，步 驟 5?7)。從交界面處獲取并離心收 集 D R M (見基本方案，步 驟 8b?IOb) ，使 用 S W 2 8 而不用 S W 4 1 轉子并且按比例增加體積。

3.D R M 沉 淀 中 加 入 I m l 甲醇，劇 烈 振 蕩 至 沉 淀 懸 起 ，移 入 帶 有 T e f l o n 內襯蓋子的1 5 m l 玻璃管中。用 I m l 甲 醇 洗 2 次 ，將每一次的洗液合并入原管。再 加 入 3m l 氯

仿 ，隨后加入 6 ml 1 : 1 (W V ) 甲醇和氯仿混合物。

4 . 應用高強度浴槽型超聲破碎儀（推薦使用）或者標準超聲破碎儀處理幾秒。室溫振蕩孵育過夜。在真空中用 24m m Whatman G F /C 玻璃纖維濾器過濾到 125m l 側臂燒瓶中。

5 . 用 IOml I : I (V7 V ) 甲醇和氯仿溶液沖洗過濾器。將溶液倒入一個適用于旋轉蒸發器的帶磨口玻璃瓶頸的 125m l 平底燒瓶中，用旋轉蒸發器干燥。置 5m l 溶劑 A 中溶解脂質。

6 . 用玻璃棒將一小卷玻璃棉塞到一個 IO m l 寬口玻璃移液管的尖端。把柱子裝在環狀支架連接或者用夾子夾住。將 2 m l 硅烷化試劑注入移液管和玻璃棉。 5m l 甲醇沖洗并且確保玻璃棉沒有沾在移液管內側壁上。

7 . 用一只 IOm l 硅烷化移液管，向柱內加入足夠量的 D E A E 葡聚糖凝膠以形成一個 2m l 柱床。用 10 倍柱體積的溶劑 A 填塞柱子。用巴氏移液管將溶解的脂質上柱。用 10 倍柱體

16.用 I : I (V /V ) 氯仿/甲醇溶解脂質。調整每個樣品的濃度，預計上樣量為 5?20ul(每種脂質含量在 1?7/xg) 。 試驗幾種濃度以確保有一種濃度在標準曲線范圍內。

17.用改良的 10M1 Hamilton 注射器上第一個樣品，在起始線的兩個點之間點入一系列擴 散 至 5m m 寬的極小液滴。使溶劑短暫干燥后接著在前一樣品上點入更小的液滴，持續點樣直至所需的上樣量。

1 8 . 將剩余樣品上樣，并選取合適的中性或酸性脂類對照，上 樣 5 ul (含 1 ? 7ug脂質），將平板室溫干燥 5m in 。 臨用前在帶磨口玻璃塞的 IOOm l 量 筒 中 配 制 70. 8m l 溶 劑 I :4 2 m l 氯仿、 1 8m l 甲醇、 7 . 2 m l 乙酸、 2 . 4 m l 甲酸和 1 . 2m l 蒸鎦水。

19.在 T L C 缸中加入溶劑和吸水紙，使吸水紙飽和，立 即 以 玻 片 蓋 住 并 以 重 物（如兩個裝滿液體的 4L 水罐）壓住防止揮發。將 點 有 樣 品 的 T L C 平 板 放 于 T L C 缸 中 ，使起始位置處在缸底部，立即蓋上并壓上重物。

20.溶劑前沿泳動至距離平板底部 6 cm (到達事先用鉛筆標記的位置）時 ，從缸中取出平板，風 干 15?30 min。如果有必要也可用電吹風的冷風吹干。溶劑揮發期間可同時在帶磨口玻璃塞的IOOml 量筒中配制 102m l 的溶劑體系 II: 65m l 己燒、 35m l 異丙 醚 和 2m l 乙酸。

21.在另一個 T L C 缸中加入溶劑和吸水紙，使吸水紙飽和，立即蓋住防止揮發。當第一溶劑揮發后，將點有樣品的T L C 平板放于 T L C 缸中。泳動至溶劑前沿到達平板頂 部（10c m )。從缸中取出平板，風 干 15?30 min。將用過的溶劑丟棄，吸水紙徹底風干留作再次使用（可重復使用若干次）。

22.將平板浸于脂類顯影試劑中，或者在通風櫥中將該液體噴于板上，使其濕透。將其豎起流干液體至板的光澤淡去。

23.將平板置于預熱 100°C 的烤箱中烘干 1 ?2m in ， 待其顏色改變之前取出，然后放置于另一 1 8 0 °C 烘箱中的 0. 5?I . O cm 厚鋁塊上干燥 5?lO m in ， 至顏色充分顯現但尚未出現背景顏色時取出，冷卻待用，如 需 要 保 存（可 達 24 h) ，則 應 以 舊 的 T L C 平

板（其上硅膠均已去除）覆蓋，用塑料膜包裹住，保存于一 20°C 。

2 4 . 在 24 h 內以密度儀掃描色帶，利用中性或酸性脂質標準品繪制標準曲線，將樣品與適當的標準曲線進行比對測定。