實驗方法原理 在含有特異抗體的瓊脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，當抗原向周圍擴散后與瓊脂中抗體相結合，即形成白色沉淀環，其直徑或面積與抗原濃度呈正相關。同時用標準抗原或國際參考蛋白制成標準曲線，即可用以定量檢測未知標本的抗原濃度(mg/ml 或U/ml)。
實驗材料 馬抗人 IgG 血清
試劑、試劑盒 離子瓊脂生理鹽水瓊脂 PBS標準參考蛋白
儀器、耗材 微量加樣器打孔器濕盒瓊脂板紗布泡沫塑料
實驗步驟
一、實驗材料
2%離子瓊脂或生理鹽水瓊脂（內含2%NaN3）。
標準馬抗人 IgG 血清（抗體）（北京生物制品研究所生產）
工作標準參考蛋白（北京生物制品研究所生產）
pH7.2 PBS
打孔器（孔徑3 mm）及打孔模板
微量加樣器
濕盒（容器內加濕紗布或泡沫塑料）
已制備好的含有 1%馬抗人IgG 抗體的瓊脂板
1/50 稀釋的單人份待檢血清標本
二、實驗方法
1、標準曲線的制備
（1）按照玻片的大小，準備制做瓊脂板所需要的1%離子瓊脂。首先分裝其1/2 量的2%鹽水瓊脂，例如，用普通載玻片制做時需1%離子瓊脂4 ml，在分裝2%鹽水瓊脂時即為2 ml。溶化后置56°C~60°C 水浴中平衡溫度備用。
（2）稀釋抗體，用pH7.2 的PBS 稀釋標準抗人IgG 抗體，終濃度為抗體效價的一倍。例如，血清效價為1/140，原濃血清即應按1/70 稀釋。并分裝試管，其分裝量應與2%鹽水瓊脂量相等。
（3）制備瓊脂板：將已稀釋的抗人IgG 抗體于56°C 水浴中預熱約半分鐘，再傾注于已溶化并維持56°C~60°C 的2%鹽水瓊脂管中，用拇指將管口堵緊。翻轉試管1-2 次，將抗體與瓊脂混合均勻（注意：抗體與瓊脂混合時切勿產生氣泡），即刻傾注于玻片上，待凝固后即可。
（4）打孔：將瓊脂板置于模板上，在同一直線上用打孔器打孔5 個，孔距10 mm。
（5）稀釋不同濃度的標準參考蛋白（工作標準）：應根據制品說明進行稀釋，例如：工作標準中免疫球蛋白含量，IgG 為100 單位/ml，80.4 微克/單位，其稀釋范圍為1/10、1/20、1/40、1/80 及1/160。
（6）加樣：將已稀釋的不同濃度的工作標準蛋白依次用微量加樣器每孔加入10 ul。（注意：每一稀釋度均應更換塑料吸頭）。
（7）將加樣的瓊脂板放濕盒中，置37°C 溫箱，24 小時后觀察結果。
（8）用量角規測量并記錄沉淀環直徑，然后以沉淀環直徑為縱座標，以標準參考蛋白量（單位/ml）為橫座標，繪制成標準曲線。
2. 人血清中 IgG 正常值的測定
（1）將已制備好的抗體瓊脂板置打孔模板上，每一瓊脂板可打孔4 個（孔徑3 mm，孔距10 mm）。
（2）將單位正常人血清用pH7.2 PBS 分別作1/50 稀釋。
（3）用微量加樣器分別取1/50 稀釋的單人份血清標本10 μl 加入孔中，每份標本應各加兩孔。
（4）作好標記放濕盒中，置37°C 溫箱，24 小時后觀察結果。
三、實驗結果
測量各份標本的沉淀環直徑并記錄結果，然后用標準曲線測出每份標本所含IgG 的量（U/ml，），并換算為mg/ml。
單向免疫擴散示意圖
注意事項
1. 在制做標準曲線時，為盡量減少誤差，至少應做兩份以上標準板。
2. 加樣時，吸取每份標本均應更換塑料吸頭。