采用細胞內熒光染料CFSE檢測淋巴細胞的遷移和增殖

基 本 方 案 淋 巴 細 胞 的 CFSE 標記

材 料（帶 V 項 目 見 附 錄 1)

實驗動物，人外周血或者培養的淋巴細胞

VPBS, pH7. 4

H a n k s 平 衡 鹽 溶 液（H B S S ) p H 7. 4

含 5 % (V /V ) 熱 滅 活 F B S 的 P B S

5m m o l / L C F S E 儲存液

0.5 m o l / L E D T A 的 P B S 溶 液（用于培養的淋巴細胞）

實驗所需的抗原和有絲分裂原

I Oml 塑 料 管（選用）

配備熒光濾片的熒光顯微鏡

注 ：細胞標記 C F S E 后不能馬上檢測，因為這時的熒光強度極髙。細胞攝入的大部分 C F S E 尚不穩定，在隨后的幾天內會逐漸丟失。

la. 細胞數較多時：用 附 錄 2 H 、單 元 2. 1 和 單 元 8. 1 中介紹的方法制備淋巴細胞，人P B M C 用 PBS (無血清）混懸至 5 0 X 106 個細胞/m l ，小鼠淋巴細胞用 H B S S (無血清）混懸至相同濃度。

lb. 細胞數量較少時：用 含 5 % F B S 的 PBS (蛋白質可減弱 C F S E 的毒性）混懸新鮮分離的淋巴細胞，使濃度為〇? 5 X 106?IOXlO6 個細胞/ml 。

lc. 培養的淋巴細胞：不要離心靜息的淋巴細胞。將標記試劑直接加在含 1 0 % F B S 的培養基中。

2 . 用 P B S 將 5m m o l /L C F S E 儲存液按 1 / 1 0 0 比 例 稀 釋（50 Mmol/L 濃度）。每毫升細胞懸液中加入 110ul 上述溶液并迅速混勻。例如，將細胞懸液加入 IOml 塑料管，保持塑料管豎直，將 C F S E 加在管壁干燥的部分。保持豎直的塑料管蓋上蓋子后迅速顛倒幾次混勻。或者一邊振搖細胞一邊加入等體積的預先稀釋至 lOumol/L 的 C F S E 。
如果上述方法用于大量細胞，應將淋巴細胞濃度從 5 0 X 10⁶ 個細胞/m l 提 高 至 1 0 0 XIO⁶ 個細胞/m l 。如果計劃在 24 h 以內檢測 C F S E 標記的細胞，應采用常用 C F S E 濃度 的 1/4 或 1/8 進行標記。

3a 分 離 的 淋 巴 細 胞 ：室溫孵育 5min 后，加 入 1 0 倍 體 積 的 含 5 % FBS 的 PBS,20℃，300 g 離 心 5min,棄 上 清 。洗 3 遍 ，每 遍 加 入 1 0 倍 體 積 的 5 % F B S 的 P B S ，2 〇 °C ， 30 〇 g 離 心 5 min，棄上清。

3b. 培養的淋巴細胞：用 P B S 洗 滌 過 后 加 入 0.5 mmol/L E D T A 的 P B S 溶 液 孵 育 5 min去除團塊。再 用 P B S 洗一遍后用培養基混懸備用。

4 . 將 C F S E 標記的淋巴細胞用不含蛋白質（無血清）的組織培養基混懸后靜脈注射（i.v . ) 至受者動物體內。如實驗對象為小鼠，則 將 I X l O ⁶?40 X 10⁶ 個 細 胞 在 0 . 1?
0.2 m l 的液體中注入尾靜脈（注射超過 50 X 10⁶ 個細胞會使小鼠淋巴器官達到飽和；在此飽和點之前注射細胞數與進入淋巴器官的細胞數呈線性關系）。

通過采用不同的 C F S E 標記濃度可以同時追蹤兩種不同的淋巴細胞群體。一群細 胞 以 5u m o l / L 的 C F S E 標 記（步 驟 I a 和 I b ) ， 另 一 群 以 常 用 農 度 的 1/4(1.25;xmol/L ) 或 1/16 (0.312jumol/L ) 進行標記。

24 h 內檢測過繼到動物體內的細胞時，為避免流式細胞儀上出現超出檢測范圍的熒光強度，應采用常用濃度的 1/4 (1.25umol/L 或 1/8 (0.625 Umol/L ) 進行標記（步 驟 1 和 2)。

5 . 用帶濾光片的熒光顯微鏡觀察淋巴器官和其他組織中 C F S E 標記細胞的位置，或采用 焚 光 素 的 特 異 性 抗 體 進 行 免 疫 組 織 化 學 檢 測（Garton and Schoenwolf， 1996;Graziano 衫 aZ.， 1998)。用熒光顯微鏡觀察 C F S E 標記的細胞時，取出動物器官，切成 約 3m m 的薄片，放于載玻片上觀察。

在熒光顯微鏡下觀察會讓 C F S E 熒光迅速泮滅，用傳統組織學染色會使其完全泮滅。如需較低解像度進行短時間定位分析，推 薦 使 用 H 33342 (Parish， 1999)。如需較高解像度定位研究，推 薦 用 組 織 切 片 的 免 疫 組 織 化 學 方 法 檢 測 C F S E 標記細胞。

6 . 用 培 養 基 混 懸 C F S E 標 記 的 細 胞 ，在 體 外 用 抗 原 或 有 絲 分 裂 原 刺 激（單 元 2. 7、2. 11、 8. 8 、 8. 9)0

7a. 獲取體內細胞：收集淋巴器官，制 成 單 細 胞 懸 液（附 錄 2 H 和 單 元 2.1)。

7b. 收獲同一種體外培養細胞：收集培養細胞，用 3m l P B S 洗一遍，用 2m l 0. 5 mmol/LE D T A /P B S 混懸， 37 〇 C 孵 育 5m i n 分解細胞團塊。 20oC ， 300 g 離 心 5 min，用 含 5 %F B S 的 P B S 混懸細胞后轉移至流式管中。如果需要用血細胞計數板進行人工計數(附錄 3A )，取少量細胞懸液放在另一個離心管中或 V 底板中置冰上保存。

7c. 收獲多種體外培養細胞：從 9 6 孔平底板中收集細胞時，吸取適量上清后將三孔細胞 轉 移 至 96 孔 V 底板的一個孔中。采 用 步 驟 7b 的方法 加 入 150M1 E D T A 洗一遍。在培養板架上 300 g 離 心 2 min。用移液器沿孔壁由上向下吸取上清，直到槍頭的尖端到達垂直管壁和 V 形底的交界處。在振蕩器上振動培養板混勻細胞，隨后用多通道移液器加入下一步洗滌試劑。

輔 助 方 案 流 式 細 胞 儀 分 析 CFSE 標記的細胞

本方案總結了對 C F S E 標記細胞的增殖進行定量分析的實驗步驟。關于流式細胞分析的更多信息參見第四章。

材料

C F S E 標 記 的 細 胞（見基本方案）

能檢測三色熒光的流式細胞分析儀

流 式 細 胞 分 選 儀（選用）

1 . 根據實驗需要對細胞進行流式標記（例 如 ，細胞表面標記，單 元 4 . 1 ; 胞內細胞因子染色，單 元 5. 8 ; 碘化丙錠染色分析細胞凋亡，單 元 2. 14)。進 行 流 式 細 胞 分 析（單元 4. 2)。

對于軟件分析

2a. 用 合 適 的 軟 件（如 Quantumsoft’s Profit、 SPSS Science’s Peakfit、 Verity SoftwareHouse’s ModFit、 Science Speak，s C F S E Modeler) 對 C F S E 峰值進行分析。

對于人工計算

2b. 記 錄 C F S E 標記的對照細胞，以及未標記的對照組和刺激組細胞熒光強度的幾何均數（未標記的增殖細胞的自發熒光要高于未標記的對照不增殖細胞）。

3b. 從 C F S E 標 記 的 對 照 細 胞 熒 光 強 度 幾 何 均 數 中 減 去 相 應 的 未 標 記 細 胞 對 照（如600-2 = 598)。將所得數值換算成 1 0 的 對 數（本 例 為 2.776)。

4b. 確定子代細胞的幾何平均熒光強度。子代細胞熒光強度為不增殖細胞熒光峰值的1/2、 1/4……以此類推，所以每分裂一次熒光強度減去 0.3logl0 。

細胞頻率的局限性在于，只能在分裂細胞熒光強度與未刺激細胞的自發焚光重疊之前進行分析。