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  • 發布時間:2020-08-18 09:52 原文鏈接: 電鏡酶細胞化學實驗

    實驗方法原理

    電鏡酶細胞化學反應分兩步:

    ①細胞內酶在一定條件下與底物進行初級酶反應(形成初級產物);

    ②應用捕捉劑與初級產物反應形成電子致密物質。

    電鏡酶細胞化學捕捉方法很多,最常用于水解酶類的為金屬鹽沉淀法和應用于氧化還原酶類的為嗜鋨物質形成法。金屬鹽沉淀法原理是酶反應初級產物與重金屬結合形成不溶解的電子致密物,常用鉛、鈰等。嗜鋨物質形成法原理是氧化酶類和二氨基聯苯胺(DAB)反應形成嗜鋨中間產物,然后與鋨形成高電子密度的鋨黑沉淀。

    實驗步驟

    1. 取材組織取材 10 mm × 5 mm × 5 mm 左右大小,固定后用振蕩切片機切成 40~100 μm 厚片,也可用剃須刀片手工切厚片。取白細胞和骨髄時采用細胞分離液分離外周血。取培養細胞時用橡皮刮。游離細胞經離心(800 r/min)5 min,凝塊后用剃須刀片切成厚片,漂洗備用。

    2. 固定固定方式與免疫電鏡基本相同,分為血管灌注固定(10~15 min)、浸泡固定(15~30 min)、微波輻射固定(5~10 s),并控制溫度。

    3. 置換緩沖液將組織厚片換入配制孵育液用的緩沖液中,換液 3 次,每次間隔 5~10 min。

    4. 孵育把組織厚片放在新鮮配制的孵育液中,在振動式恒溫水浴箱中孵育。孵育溫度和時間可根據不同酶和組織通過實驗確定。

    5. 漂洗厚片先用配制孵育液的緩沖液漂洗,一般換 3 次,每次間隔 5 min,然后用 0.1mol/L 二甲胂酸鈉緩沖液漂洗 3 次。

    6. 后固定用二甲胂酸鈉配制的 1% 四氧化鋨固定 1~2 h。

    7. 包埋按超薄切片技術中的常規方法進行梯度脫水及樹脂浸透、包埋。

    8. 超薄切片與染色常規超薄切片,鈾、鉛染色。

    9. 對照實驗電鏡細胞化學反應的對照實驗同樣也是必不可少的,主要有以下幾種方法:

    9.1 去除孵育液中的底物;

    9.2 孵育液中加特異性抑制劑;

    9.3 高溫使酶失活,一般 60℃1 h 以上可以滅活酶的活性。


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