又到了一周云序生物課堂開講時間！你，準備好了嗎？
上一期文章當中，云序通過引用這樣一張表格給大家傳遞了一個重要信息：表中的METLL3、METTL14、NSun2、FTO、ALKBH5、YTHDF2均是RNA甲基化重要的酶，而且這些酶在不同疾病當中意義有所不同，例如METTL3在AML、BC、HCC當中都是原癌基因，而到了GBM當中竟然變成了抑癌基因；同樣是甲基化酶，在HCC當中，METTL3是原癌基因而METTL14是抑癌基因。不管怎樣這些酶都在疾病當中扮演重要角色，對疾病細胞的侵襲、增殖能力都有所影響，那么如何做到圍繞一個酶把故事的來龍去脈講清楚呢？
RNA甲基化從酶入手，高分文章立刻擁有，截至目前，RNA甲基化相關領域的研究仍在起步階段，但圍繞甲基化酶研究的思路已經是高分文章的首選策略。云序生物課堂，今天就想跟大家聊聊，如何從酶入手打造高分RNA甲基化文章：
1. 確定相應疾病背景下的酶
RNA甲基化相關的酶包括甲基化酶、去甲基化酶、識別蛋白三大類，到底選哪一個酶來做？良好的開端是成功的一半，哪個酶最值得研究成了首要問題。
RNA-seq檢測相關酶的表達量改變
（DOI: 10.1111/acel.12753）
倍數表達變化改變總結
（DOI: 10.1002/hep.29683）
1）云序生物推薦mRNA測序結合qPCR的方式檢測酶變化
mRNA測序能給出疾病模型或疾病樣本中異常表達的所有基因，其中包括RNA甲基化相關的METTL14、METTL3、FTO和ALKBH5等重要的酶在RNA水平上的變化檢測。在設置生物學重復的前體下優先選擇倍數表達變化高的并且p值較小的酶作為潛在的研究靶點。qPCR技術可以對選擇的靶點酶進行擴大樣本量驗證用于確定該酶的異常表達。
相關酶的WB蛋白檢測
（https://doi.org/10.1038/s41590-018-0275-z）
2）蛋白檢測
不僅局限于RNA水平，云序推薦結合Western Blot技術檢測酶在蛋白水平上的變化，如果在RNA水平和蛋白水平都提供有力的證據證明酶表達量改變，則為接下來的實驗奠定了堅實的基礎。
大樣本qPCR驗證ALKBH5高表達與較差臨床預后有關
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
3）數據挖掘
對于常見疾病，如癌癥，現有的數據庫已經有了相當豐富的疾病表達數據以及臨床診斷和預后相關分析，友好的網頁界面方便用戶簡單點擊鼠標就可以快速知道疾病相關的表達圖譜，這當然一定包含這些酶的信息。漂亮的生存曲線輕松繪制，臨床效果顯著相關的信息對于靶點的選擇又是一劑強心劑。
綜上，評價一個酶是否可以作為靶點進行研究主要看三方面，RNA表達改變（變化倍數和p值）、蛋白表達改變和臨床意義。
2. 實驗室中復盤酶的重要生物學作用
ALKBH5對細胞增殖的影響
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
METTL3促進腫瘤生長
（https://doi.org/10.1002/hep.29683）
1）最直接的方式就是對該酶進行過表達或敲除實驗并觀察細胞表型是否有改變
對于表型的定義針對不同類型的疾病模型有所區別，腫瘤細胞的細胞表型就是我們所熟知的細胞侵襲、增殖等。另外，裸鼠成瘤實驗是證實甲基化酶調控細胞成瘤過程最直接手段。
整體水平RNA m6A比色法檢測（Elisa試劑盒）
（DOI: 10.1002/hep.29683）
2）整體水平評價甲基化水平改變
甲基化酶或者去甲基化酶的過表達與敲除理論上會造成甲基化水平的廣譜改變，此時可以使用商業化的比色法試劑盒來說明酶的人工干預對甲基化水平產生了影響。
3. 多組學聯合運用找靶點：轉錄組測序甲基化測序，雙劍合璧
多個表達譜數據取交集找到靶基因
（DOI: 10.1002/hep.29683）
甲基化數據同表達譜數據取交集
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
1）云序生物推薦MeRIP-seq測序技術對干預和未干預的生物學樣品進行m6A甲基化測序，測序結果中會呈現甲基化位點的具體位置和差異甲基化位點的位置。測序結果當中會呈現超甲基化、去甲基化、高表達、低表達的相關基因，而建立這一關系的理論依據是甲基化水平的改變會造成RNA水平的改變。目前RNA甲基化使RNA水平下降是廣泛接受的結論，影響方式可以通過降低RNA分子同HuR結合蛋白的結合力而使穩定性下降，也可以通過YTHDF家族蛋白識別并降解RNA的途徑使RNA水平減少。是否有RNA甲基化能促進RNA的表達水平？目前還尚沒有定論。
4. 靈活展示酶與下游靶基因的關系以及其他功能實驗
確定了酶和酶潛在靶基因間的關系。通過整合多篇高分文章的內容，為大家梳理一下思路。
IGV軟件上觀測到靶基因上存在4處RNA甲基化的區域
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
1）驗證靶基因的甲基化，mRNA和蛋白表達情況
任何高通量測序的結果都需要通過低通量的驗證，通過MeRIP-qPCR，qRT-PCR和WB分別驗證靶基因的甲基化和表達量情況。其中，若靶基因mRNA的表達量不改變，也不用太擔心，因為甲基化修飾可能改變了該基因的蛋白翻譯效率，做個WB試試。
RIP實驗證實ALKBH5酶與靶基因直接結合
（DOI: 10.1002/hep.29683）
RNA Pull Down實驗證實靶基因能與ALKBH5蛋白直接結合
（DOI: 10.1002/hep.29683）
2）RNA甲基化酶是否和靶點基因的mRNA直接結合
通過RIP實驗，特異性借助RNA 甲基化酶抗體拉取樣本中與其直接結合的RNA，再通過qRT-PCR手段，檢測靶基因是否存在于拉取的復合物中，從而決定性的證實甲基化酶與靶基因是直接結合的。相反的，RNA Pull Down實驗，借助根據靶基因合成的探針，特異性拉取與其結合的蛋白，通過WB手段，檢測甲基化酶是否存在于拉取的復合物中。這樣一來一往，就能明確兩者是直接結合的。
3）解釋酶對甲基化靶基因影響的工作原理
從酶入手研究RNA甲基化策略是這類高分文章的主流，上游的酶，下游的靶基因，建立聯系一氣呵成，根本上解釋了甲基化酶、去甲基化酶以及識別蛋白通過靶基因對疾病的調控作用。云序生物提煉的這一思路適用于大部分疾病的RNA甲基化研究探索，RNA甲基化研究這么熱，這么新，為什么不嘗試用這種方式解釋您關心的疾病、表型變化中甲基化所起到的作用呢？歡迎廣大老師來電咨詢云序技術團隊，云序竭誠為您服務。
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