實驗方法原理
大腸菌群系指一群能發酵乳糖，產酸產氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量，具有廣泛的衛生學意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。食品中大腸菌群數系以每100
g（或ml）檢樣內大腸菌群最近似數（the most probable number 簡稱MPN）表示。
實驗材料 乳肉蛋制品飲料糕點發酵調味品大腸埃希氏菌產氣腸桿菌
試劑、試劑盒 單料乳糖膽鹽發酵管雙料乳糖膽鹽發酵管乳糖膽鹽發酵管伊紅美藍瓊脂革蘭氏染色液蛋白陳水靛基質試劑麥康凱
儀器、耗材 溫箱水浴鍋天平顯微鏡均質器乳缽溫度計平皿試管發酵管吸管載玻片接種針
實驗步驟
一、采樣及稀釋
1.
以無菌操作將校樣25 g(或25 mL)放于含有225
mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無菌均質器，以800
r／min—1000 r／min的速度處理1 min，做成1：10的稀釋液。
2. 用1 mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1 mL，注入含有9 mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖混勻，做成1：100的稀釋液，換用1支lmL滅菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋液。
3. 根據食品衛生要求或對檢驗樣品污染情況的估計按種3管。也可直接用樣品接種。
二、乳糖初發酵試驗
即通常所說的假定試驗。其目的在于檢查樣品中有無發酵乳糖產生氣體的細菌。
將待校樣品接種子乳糖服鹽發酵管內，接種量在1 mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發酵管1 mL及1 mL以下者，用單料乳糖發酵管。每一個稀釋度接種3管，置(36土1) ℃培養箱內，培養(24土2) h，的所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性，勿有產生者，則按下列程序進行。如有產生者，則按下列程序進行。
三、分離培養
將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂板或麥康凱瓊脂平板上，置(36土1) ℃溫箱內，培養18 h一24 h，：然后取出，觀察菌落形態并作革蘭氏染色鏡檢和復發酵試驗。
四、乳糖復發酵試驗
即通常所說的證實試驗，其目的在于證明從乳糖初酪管試驗呈陽性反應的試管內分離到的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，確能發酵乳糖產生氣體。
在上述的選擇性培養基上，挑取可疑大腸菌群1—2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發酵管，置(36士l) ℃的溫箱內培養(24土2) h，觀察產氣情況。
凡乳糖發酵管產氣．革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌，即報告為大腸桿菌陽性糖發酵管不產氣或革蘭氏染色為陽性，則報告為大腸桿菌為陰性。
五、報告
根據證實為大腸菌群陽性的管數，查MPN檢索表(見表5—4)，報告每100 mL食品中大腸菌群的最可能數。
六、大腸菌群最可能數(MPN)檢索表中數值的計算
大腸菌群最可能數檢索表中數值，系通過幾率計算出來的。由于我國在大腸菌群檢驗中，對檢樣采用了三個不同的lo倍遞減接種量，每個接種量各接種丁3個乳糖膽鹽發酵管。因此，乳糖陽性管可能只出現在一個管組內，也可能出現在兩個管組內，或者三個管組內部出現。為此，就乳糖陽性管出現的這三種不同情況各舉一例，以說明檢索表中最可能數求出的情況。
1．僅有一組乳糖發酵管內有大腸菌群存在時．用公式（1）計算：
Nλ＝2.303×lgA/B （1）
N——檢出大腸菌群的乳糖發酵管所加樣品量；
λ——大腸菌群的最可能數，個／mL或個／g；
A——加進所有各管組乳糖發酵管內樣品的總量；
B——所有各管組未檢出大腸菌群管中樣品的總量。
例1；管 組 ① ② ③
管 數 3 3 3
每管內樣品量 10mI 10mL 10mL
陽 性 管 數 3 0 0
因此，N＝10 A＝33.3 B＝3.3
代入公式(1) 得
10λ=2.303×lg33.3/3.3
=2.303×lg10.091
=2.3
λ＝0.23個／mI
所以每100mL樣品內大揚菌群最可能數為23個。根據表5—4中樣品接種量較例1低10倍，故其大腸菌群效應為230個。
2. 兩組乳糖發酵管內有大腸菌群存在時，用公式(2)計算
式中 N1P——管組②每管內加N1mL(g)樣品量，有P個大腸菌群陽性管；
N2γ——管組②每管內加N2mL(g)樣品量，有γ個大腸菌群陽性管；
γ——大腸菌群的員可能數(個／mL或個／g)；
A——加進所有各管組乳糖發酵管內樣品的總量；
B——所有各管組未檢出大腸菌群管中樣品的總量。
應用公式(2)時，須先假定λ值，用試算法代進公式內以計算出k值，當代進公式的假定值與計算出的λ值相符(或最接近時)時，則所假定的λ值，即為大腸菌群的最可能數。
例2：管 數 ① ② ⑧
管 數 3 3 3
每管內樣品量 10mL 10mL 0.1mL
陽 性 管 數 0 3 2
因此，N1=1 N1P=3 N2=0.1 N2γ=0.2 A=33.3 B=30.1
設λ=0.16個/mL，代入上式得：
lgK＝一0.4343×0.1×0.16
＝1.9930512
所以，K=0.98412712
將以上各值代入公式(2) 得：
＝2.303×0.0679963
＝0.1565955
此計算的λ值與所假設的λ值相符，因此大腸菌群最可能數為0.16個／mL，由表5-4中樣品接種量較例3低10倍，故大揚菌群數應為160個。
3．三組乳糖發酵管內都有大腸菌群存在時，用公式 (3) 計算：
式中 A——加進所有各管組乳糖發酵管內樣品的總量；
B——所有各管內未檢出大腸菌群管中樣品的總邑，
N1P——管組①每管加入N1 mL(g)樣品，有P個大腸菌群陽性管；
N2γ——管組②每管加入N2 mL(g)樣品，有γ個大腸菌群陽性管；
N3t——管組③每管加入N3 mL(g)樣品，有t個大腸菌群陽性管；
λ——大腸菌群的最可能數，個／mL或個／g。
應用公式(3)時，與應用公式(2)相同，也須先假定λ值，用計算法代入公式內以計算出λ值，當代進公式的假定值與計算出的λ值相符(或最接近)時，則所假定的λ值，即為大腸菌群的最可能數。
例3：管 數 ① ② ⑧
管 數 3 3 3
每管內樣品量 10mL 10mL 10mL
陽 性 管 數 2 3 1
因此，N1=10 N1P=20 N2=1 N2γ=3 N3t=0.1 A=33.3 B=10.2
設λ＝0.36個／mL，代入①②③式可得；
lgK1＝-0.4343×l×0.36
＝一0.156348
所以，K1=0.69767312
lgK2＝0.4343×0.1×0.36
＝-0.0156348
K2＝0.96464
lgK2＝0.4343×（1+0.1）×0.36
＝-0.1719828
所以，K3＝0.6730033
將以上各值代入公式 (3) 得：
10λ＝2.303×
=2.303×lg37.705191
=3.6304517
所以，λ＝0.363045l7
由計算結果的λ值與所假設的λ值相符，因此大腸菌群員可能數為0.36個／mL(g)所以100mL(g)樣品中大腸菌群最可能數為36個，根據表5—4中樣品接種量較例3010倍，故大腸菌群最可能數為360個。