云序生物連續數周頻頻收到客戶捷報，各領域工作全面開花。在10分RNA甲基化文章剛剛發表后，環狀RNA研究又陸續有優秀文章發表，我們已連續兩周為大家解析云序客戶環狀RNA研究，包括世界第一篇小鼠大腦創傷外泌體環狀RNA研究以及世界第一篇非洲爪蟾環狀RNA研究。這周我們為大家帶來中國醫科大學附屬第一醫院周華教授課題組最新工作，環狀RNA—CircHLA-C通過競爭性吸附miR-150，在紅斑狼瘡性腎炎（lupus nephritis, LN）中起到重要作用。本文于近日發表在Cell子刊“Molecular Therapy Nucleic Acids”（影響因子 6.392）上。
研究背景：
環狀RNA是一類新發現的非編碼RNA，研究人員已在多種組織及疾病中對其開展了功能研究，但在腎小球及腎小管間質疾病中研究尚未開展。本文著力于解決環狀RNA在紅斑狼瘡性腎炎疾病中的調控作用。據了解，環狀RNA主要以miRNA海綿機制發揮生理功能，通過競爭性結合miRNA以調控疾病的發生發展。作者前期研究發現miR-150在紅斑狼瘡性腎炎中起調控作用，本文依托高通量測序聯合生信分析（文中環狀RNA測序工作由云序生物提供）找到疾病中差異表達上調的CircHLA-C可與miR-150特異性結合，協同調控紅斑狼瘡性腎炎。
研究思路：
作者前期工作表明miR-150表達與紅斑狼瘡性腎炎患者（LN）腎慢性衰竭指數正相關。在這項工作中作者希望找到與miR-150協同作用，調控LN的環狀RNA分子。因此作者選取7例LN腎臟組織及6例正常腎臟組織進行環狀RNA測序，共鑒定到171個顯著性差異表達環狀RNA分子。選取10個環狀RNA分子進行qPCR驗證，7例與測序結果吻合。這其中，CircHLA-C表達與腎病臨床指標蛋白尿、血清肌酸酐以及腎組織活動等具有正相關性。疾病組中CircHLA-C表達提高2.72倍，miR-150下降66%。生信預測顯示CircHLA-C與miR-150具有結合位點，且二者表達具有負相關性。作者首次證實在紅斑狼瘡性腎炎中環狀RNA——CircHLA-C可能通過海綿機制競爭性結合miR-150，影響疾病發生發展。
研究一：環狀RNA表達譜
LN患者男女比例為9:1，因此作者收集臨床樣本時，選取6例女性及1例男性LN IV級腎病變組織進行研究。作者通過對疾病組及正常組二代高通量測序，繪制了LN疾病環狀RNA表達譜。譜中共檢測到18505表達變化環狀RNA，其中11411例上調（142顯著上調，FC>=2, p-Value <=0.05），7094例下調（29顯著下調，FC<=2, p-Value <=0.05）。171條顯著性差異表達的環狀RNA中，共有39條為首次發現。統計發現，這些環狀RNA長度多數小于2000nt，且呈現染色體分布全覆蓋。整體來看，76.6%的差異環狀RNA是外顯子來源環狀RNA，16.4%是Sense overlapping來源環狀RNA，7%其它來源的環狀RNA。
研究二：環狀RNA功能預測
目前發現環狀RNA體內主要作用機制為miRNA海綿，作者前期工作證實LN疾病中miR-150等miRNA發揮重要功能。因此作者選取了40條顯著性差異表達（20條上調最顯著，20條下調最顯著）的環狀RNA，繪制了其與miRNA相互作用網絡圖，生信層面預測了環狀RNA可能行使的miRNA海綿功能。后續，作者通過GO分析及KEGG分析，預測了這些差異表達的環狀RNA在體內可能參與的細胞功能及信號通路。GO結果顯示，差異上調的環狀RNA來源靶基因與樹突狀細胞分化及mRNA剪切密切相關。而KEGG結果顯示，差異上調的環狀RNA來源靶基因主要參與HIF-1信號通路及NF-κB信號通路，這些都是LN中重要的調控因子。
研究三：環狀RNA驗證
高通量數據均需要低通量的技術手段輔以驗證，作者選取10例差異表達最明顯的環狀RNA進行qPCR驗證，其中7例與測序結果吻合。為了找出腎病相關的環狀RNA，作者分別驗證了這7例環狀RNA與腎病臨床檢測指標的一致性。結果發現CircHLA-C與蛋白尿（r=0.920，p=0.009），血清肌酸酐（r=0.756，p=0.082）新月體腎小球%（r=0.929，p=0.007）及腎臟活動指數（r=0.884，p=0.020）正相關。
研究四：環狀RNA與miRNA相互作用
這一部分工作中作者將前期miRNA研究成果與環狀RNA進行了關聯研究。腎臟活檢結果顯示miR-150在LN組織中表達顯著性下調，并且miR-150表達量與circHLA-C負相關。作者利用TargetScan及miRanda分析發現circHLA-C及miR-150之間具有可信度極高的結合位點。
結語：
本文依托高通量測序技術手段，首次鑒定了紅斑狼瘡性腎炎特異性環狀RNA表達圖譜。文中鑒定到的CircHLA-C是一個全新的與腎病密切相關的環狀RNA，后續對其進行分子標志物分析及分子機制的研究將會具有重大意義。
