在尋找疾病相關基因的研究中，使用基因芯片對家系進行連鎖分析，將基因定位于少數幾個區域中，接著進行外顯子組測序或全基因組重測序尋找候選區域中的遺傳變異，是一個準確高效的研究方案。本文列舉了上海交通大學醫學院附屬新華醫院皮膚科李明老師團隊的兩項研究，均使用了上述方法成功找到了疾病相關的基因變異位點。該研究中的Illumina Infinium Human OminiZhongHua-8基因芯片和外顯子組測序服務由上海伯豪生物技術有限公司提供。
研究思路
研究案例
案例一 連鎖分析和重測序揭示Basan綜合征相關SMARCAD1突變
該研究使用了連鎖分析和全基因組重測序發現了一個新的SMARCAD1基因選擇性剪切突變，此突變被認為引發了Basan綜合征。在此研究之前，已有研究在患有Basan綜合征的美國家庭鑒定出了SMARCAD1基因的5個突變。Basan綜合征是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，癥狀為可自愈的先天性肢端水皰、粟丘疹、無指紋及掌跖角化過度等。本文的研究對象是一個患有Basan綜合征的家系（見圖1）。具體病征見表1。
圖1.1. 患有Basan綜合征的家系圖譜。箭頭所指為先證者。
表1. 家系中8例患Basan綜合征的臨床表現
研究首先使用了Illumina Infinium Human OminiZhongHua-8基因芯片對整個家系樣本進行基因分型。過濾掉低質量位點，單態位點，以及不符合孟德爾定律的位點后，得到11,152個SNPs用于連鎖分析。由于Basan綜合征存在類似遺傳性大皰性表皮松解癥的臨床表現，因此先排除掉已知相關基因KRT5的突變。隨后連鎖分析得到了兩個相關區域，為4p15.31-4p14和4q13.2-4q23。
圖1.2. 全基因組連鎖分析結果。最高LOD值為3.01。
接下來，研究使用了Agilent SureSelect平臺對其中一例患者進行了外顯子測序，測序深度為100X，但并沒有發現功能相關變異。于是作者又進行了全基因組重測序，測序平臺為Illumina Hiseq XTen，測序深度為平均每堿基27.94X，得到了3,832,626個變異位點（SNP和Indel）。在使用1000 Genome、HapMap 8和dbSNP135數據庫過濾SNP后，在連鎖分析得到的相關區域中發現兩個遺傳變異。第一個為c.378 +1G>T，位于SMARCAD1基因的選擇性剪切位點，而另一個則為“GGC”重復，位于ANKRD17基因的第一外顯子。隨后，作者使用了sanger測序對這兩個變異在該家系中進行了驗證。結果發現，SMARCAD1基因的變異與臨床表現呈共分離，但ANKRD17基因與疾病無關。
本研究的意義在于確定了該家系發病原因為SMARCAD1基因上發生的選擇性剪切突變。有研究報道，該突變與無掌紋癥（adermatoglphia，ADG）相關，說明ADG與Basan綜合征是同一種疾病的不同表現。未來研究將解決該突變的致病機制。
案例二 全基因組連鎖分析和外顯子測序在Dowling-Degos病例中確定KRT5基因突變
Dowling-Degos病是一種色素性疾病，為常染色體顯性遺傳，特征為身體屈側有網狀色素沉著、顯著的粉刺樣皮疹和凹陷性瘢痕。本研究使用了患有Dowling-Degos病的家系作為研究對象，患者樣本數量為19個。
圖2.1. 患有Dowling-Degos病的家系圖譜。箭頭所指為先證者。
與上一篇研究類似，作者首先使用了Sanger測序在樣本中排除了包含已知致病基因ABCB6、POFUT1和POGLUT1突變的樣本，隨后使用Illumina Infinium Human OminiZhongHua-8基因芯片進行基因分型。連鎖分析將致病基因定位至12q13.12-12q14.1區域內，LOD值為3.19，定位精度為13.76 cM。
圖2.2. Dowling-Degos病致病基因KRT5的定位。（a）單倍型分析；（b）連鎖分析，候選區域LOD值為3.19；（c）Sanger測序驗證KRT5基因變異
隨后，對其中一例患者，研究者進行了外顯子組測序，平臺為Agilent SureSelect，測序深度為100X。在定位區域內發現了KRT5基因起始密碼子的突變c.2T>G (p.Met1?)和NEUROD4基因的一個錯義突變c.376G>A (p. Ile126Val)。經過使用Sanger測序進行突變與疾病的共分離分析，后者被排除，而前者被證明與疾病相關。
總結
這兩篇文章均首先使用基因芯片進行了連鎖分析，將候選基因定位于具體的區段上，再使用全基因組重測序尋找該區段的遺傳變異。定位到少數幾個變異后，使用Sanger測序對整個家系樣本進行測序，將基因型與表現型進行共分離分析，排除與疾病無關的遺傳突變。這種研究方法為遺傳性疾病致病基因搜尋提供了明確的研究思路。