實驗方法原理
SDS(十二烷基磺酸鈉)是一種強去污劑,可使細胞膜及核膜破裂,因此被用來分離DNA。該分離過程的第一步是用熱的去污劑(SDS)進行抽提,然后將抽提物置于0℃并加入高摩爾濃度的乙酸鉀,離心去除不溶物,以去除蛋白和多糖類雜質。
實驗材料 植物新鮮葉片
試劑、試劑盒 液氮提取緩沖液(用前加入)20%SDS(pH7.2)乙酸鉀5×TE緩沖液RNaseA乙酸鈉異丙醇TE緩沖液
儀器、耗材 天平 研缽和研棒 50ml 離心管 恒溫水浴鍋 冰盒 冷凍離心機 ( 至少可達25 000×g) - 20℃冰箱 Eppendorf 管 微量移液器及吸頭 微量離心機 冰箱
實驗步驟
1.將2g新鮮植物葉片置于液氮中速凍,用研缽磨成細粉。
2.將冷凍粉末轉移至一50ml離心管中并加入15ml提取緩沖液。輕輕旋轉混勻。
3.加入1ml20%SDS,混勻,65℃保溫10min,并不時輕輕旋轉混勻。
4.加入5ml 5mol/L乙酸鉀,混勻后冰上放置20～30min。
5.25000×g,4℃離心20min。
6.上清液用紗布過濾,轉移至一干凈的50ml離心管中,加入10ml異丙醇,輕輕顛倒混勻,-20℃放置40min沉淀核酸。
7.2000×g,4℃離心20min,去上清液,晾干沉淀5min。
8.用700μl5×TE緩沖液溶解沉淀并轉移至一Eppendorf管中。
9.加入7μlRNaseA貯液,37℃保溫1h。
10.加入75μl3mol/L KAc,輕彈混勻,離心15min沉淀不溶性雜質。
11.將上清液轉移至一裝有500μl異丙醇的干凈管中,輕輕混勻,室溫下放置5min。
12.微型離心機離心15min沉淀DNA,去上清液并用500μl70%乙醇清洗沉淀。再次離心5min,吸去乙醇。
13.沉淀物溶解于200μlTE緩沖液中,4℃保存。
注意事項
1.將SDS溶液加入到化凍的提取物中時,可能會有沉淀析出,要保證析出的SDS重新溶解,以及65℃保溫時提取物混合均勻。
2.在高濃度(>1mol/L)的鉀離子存在的情況下,SDS會與蛋白質或多糖結合變成不溶性的十二烷基磺酸鉀復合物,這類復合物通常呈絮狀,必須要經較高轉速離心和紗布過濾予以去除
其他
RNaseA 為2000U/ml,經熱處理