二、正常男性中期染色體標本的制備
1.準備一個封閉環境，其相對濕度約55%(可在50%?60%變化），溫度24?26.5℃。
2.將巴斯德吸管置于玻璃載片上方2?4in處，讓一滴細胞懸液滴在玻片的左側。然后迅速將第二滴細胞懸液滴在玻片右側（見注釋7)3.在固定液全部蒸發前，將玻片浸入盛有新鮮固定液的染色缸1?3s，將玻片自染色缸中取出，在如步驟1所述的封閉的濕度/溫度環境中晾干片子。
4.在光學顯微鏡T檢查染色體標本的質量。
5.染色體標本在室溫下過夜，然后浸入1%福爾馬林中4℃固定5?10min。
6.染色體標本系列乙醇脫水，70%、85%和100%乙醇中各2min。
7.標本在室溫下晾干，或在實驗室抽風櫥中微風吹過標本使標本快速干燥。
8.在室溫儲存標本2?4周。
9.用正常參考與正常人樣品或已知不平衡性染色體異常樣品，對其中一張染色體標本片進行CGH分析。
三、患者和正常人樣品高分子質量DNA的提取
按照生產商提供的說明書進行DNA提取。也可以選擇用標準方法或任何可靠的DNA提取試劑盒提取DNA。
四、用缺口平移法標記探針
1.熒光素-12-dUTP用于標記患者DNA，德克薩斯紅-5-dUTP用于標記參考DNA。
2.準備15℃水浴鍋，或向裝滿自來水的冰盒中加入少量的冰直到溫度降到15℃。
3.將另一個水浴鍋設置為72℃。
4.向1.5mL離心管中加入下述試劑（所有試劑置于冰上）：1μg患者或參考DNA、5μL 10×反應緩沖液混合物、5μL dNTP混合物、1μL熒光基團-dUTP(l mmol/L)、1μLDNA酶（0.01?1U/μL)和2.5μLDNA聚合酶I(10U/VL)。
5.加水至總體積50μL。
6.將離心管短暫離心，使所有試劑都沉至管底。
7.在15℃水浴中孵育60min。
8.在72℃水浴中孵育10min終止反應。
9.在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢查DNA片段大小。最適于CGH的DNA片段大小為300?2000bp(圖3)。如果片段太長，加入DNA酶I在15℃水浴中繼續孵育。
10.可以進行大量樣品的缺口平移標記。
五、CGH探針的制備在1.5mL離心管中加入下述試劑：
1.用缺口平移法標記好的正常（參考）DNA200ng。
2.缺口平移法標記好的患者DNA200ng(10iLtL)。
3.20?30μg Cot1-DNA(20?30μL)(見注釋11)。
4.1/10體積的3mol/L乙酸納。
5.150μL(大于2倍體積）100%冰冷乙醇。
6．在-80℃放置40?60min。
7.29000g(或離心機最大轉速）于4℃離心40min。
8.輕輕倒掉乙醇。
9．用無菌的有棉花尖頭的涂布器吸干殘余的乙醇（不要碰到沉淀）。
10.將離心管置于電熱板（42℃)上的金屬架上，蒸發殘余的乙醇，需時2?3min。
11．用101μL Hybrisol VII雜交混合物重懸沉淀，用上下抽吸混勻，渦旋振蕩約1min.
12.CGH探針可以直接使用或于-20℃避光保存備用