頑拗性植物組織的蛋白質組學研究（苯酚法提取蛋白質）實驗
實驗材料 植物組織
試劑、試劑盒 苯酚提取緩沖液沉淀液等電聚焦緩沖液
儀器、耗材 低溫粉碎機
實驗步驟
3.1 蛋白質提取
( 1 ) 新鮮植物組織在液氮中冷凍，然后在自動低溫粉碎機中預先冷卻的鋼杯中將材料研磨成細碎的粉末（見注釋 4) 。
( 2 ) 在一個 15 ml 的離心管（falcon tube) 中加入 3 ml 提取緩沖液，并加入 1 g 研碎的植物組織，渦旋后在冰浴中振蕩 10 min ( 見注釋5) 。
( 3 ) 加入等體積的 Tris 飽和苯酚，室溫下振蕩 10 min ( 見注釋 6)。
( 4 ) 樣品在 5500 g 和 4°C 的條件下離心 10 min，從上到下分成有機相，水相和沉淀的不溶物質（見注釋 7) ，小心地將最上層的苯酚轉移到新的離心管中，注意避免觸碰到中間層。
( 5 ) 含蛋白質的苯酚液中加入 3 ml 的提取緩沖液進行反萃取（ back- extract) 。振蕩 3 min 后渦旋。然后樣品在 5500 g 和 4°C 條件下離心 10 min。
( 6 ) 轉移上層酚相到新離心管中，并加入 4 倍體積的沉淀液。顛倒振蕩離心管，在 -20°C 條件下沉淀至少 4 h，或者過夜。
( 7 ) 離心沉淀蛋白質 （10 min、5500g、4°C ) 。
( 8 ) 離心后，用預冷沉淀液漂洗沉淀 3 次，最后用預冷丙酮漂洗。在每一次漂洗后，樣品都要離心（5 min，5500 g、4°C ) 。
( 9 ) 真空干燥沉淀（見注釋 8) 。
蛋白質首先被提取到含有幾種保護劑的 Tris 緩沖液中。EDTA 通過螯合金屬離子來抑制金屬蛋白酶 （ metalloprotease) 和多酚氧化酶（polyphenol oxidases) 。PMSF 能夠不可逆地抑制絲氨酸蛋白酶（serine protease) 。β-巰基乙醇是一種防止蛋白質被氧化的還原劑。此外，為抑制蛋白酶活性，實驗溫度必須保持在 4°C 以下，第一步提取要在冰浴中進行。盡量縮短提取時間。使用 KCl 是因為它的鹽溶性效果好，這可以提高蛋白質溶解度而有利于蛋白質提取。
相對于傳統的苯酚提取法，Wang 等提出另一種可行方法，由于加入了十二烷基磺酸鈉（SDS) ，因此稱為苯酚/SDS 提取法。這種方法明顯增大了從橄欖葉組織中的蛋白質提取量，雙向電泳比較清晰，并且比起單用苯酚得到更多更濃的蛋白點。但是，加入 SDS 不能使從香蕉、蘋果和馬鈴薯葉片中提取蛋白質的效果提高。
含蔗糖的 Tris 緩沖液比 Tris 飽和苯酚密度大。所以在相分離時，可以使苯酚相更快地分離到離心管的最上部，有利于轉移苯酚相（見注釋 7) 。在上部的苯酚相中含有胞質蛋白和膜蛋白。
pH 8.0 的 Tris 飽和酚溶液能保證核酸分離至緩沖液相中，而不使核酸留在苯酚相中。
蛋白質通常用加入鹽或者水溶性有機溶劑的方法進行分離。在這里，兩種方法都被應用。4 倍體積的甲醇可以有效地分離出大部分蛋白質。但是，甲醇從酸性溶液中提取蛋白質的效果較差。使用有機堿或緩沖液（乙酸銨）可以解決這個問題。
3.2 蛋白質的溶解和定量
( 1 ) 蛋白質沉淀重懸于 IEF 緩沖液。如果起始材料是 1 g 新鮮的番茄果實組織，需要 200 μl IEF 緩沖液。
( 2 ) 樣液需要在室溫條件下振蕩至少 1 h (有時需要更長時間）。不要加熱樣品 ，否則會導致蛋白質的氨基甲酰化（carbamylation)。
( 3 ) 定量時，需要一些用 IEF 緩沖液稀釋卵清蛋白（ovalbumin) 標準液（8 份稀釋液，分別從 0 μg/μl 到 60 μg/μl）。然后，在每份稀釋液中分別加入 10 μl 0.1 mol/L HCl。最后，無論用于制作標準曲線還是用于樣品濃度測定的樣品管，都用蒸餾水定容至 100 μl。
( 4 ) 然后加入 3.5 ml 稀釋的染色劑，并在 595 nm 讀出樣液的吸光值。
測定植物組織中的蛋白質濃度，考馬斯亮藍法 [9] 比 Lowry 法 [ 10] 及 Biuret 法更合適，因為后兩者都是基于定量酚類化合物 [1] 。但是，由于 IEF 緩沖液成分的干擾，不易在樣品緩沖液中直接定量。因此，我們采取改良的 Ramagli 和 Rodriguez，它基于樣品緩沖液的酸化處理，即使緩沖液里含有尿素、載體兩性電解質（carrier ampholytes)、非離子去垢劑和硫醇類化合物，仍可用于直接定量溶于樣品緩沖液里的蛋白質。