實驗材料 異丙基 β-D-硫代半乳糖苷
試劑、試劑盒 非變性裂解液非變性洗滌液非變性洗脫液苯甲基磺酰氟
儀器、耗材 超聲勻漿器聚丙烯柱
實驗步驟
3.1 非變性條件下重組激酶的純化
用于磷酸化篩選的激酶必須是可溶和有活性的，且無其他激酶參雜的純化激酶。因此，我們可以從 cDNA 表達文庫中，大量生產和純化組氨酸標記的重組蛋白質激酶，這些 cDNA 表達文庫包括，用大腸桿菌載體 PQE30NST ( 檢索編號：AF074376；22 ) 構建的大麥表達文庫，或用 pQE30NASTattB 載體（檢索編號：AY386205；23；也可見 28.3.1 ) 構建的擬南芥表達文庫。我們用以下方法從這些文庫中表達并純化蛋白激酶。
表達：
( 1 ) 在 Falcon 離心管（50 ml ) 中加入 10 ml 細胞培養基。
( 2 ) 將培養物與表達組氨酸標記蛋白激酶的細菌一起接種到培養基中，這些細菌取自于保存于 -80°C 的 384 微孔板。
( 3 ) 經 37°C 劇烈搖晃過夜培養后，將細胞培養物轉移至含有 90 ml 預熱的 2YT 培養基的 300 ml 三角瓶中，2YT 培養基中含 100 μg/ml 氨芐青霉素，15 μg/ml 卡那霉素。繼續培養至 OD 值達到 0.7。
( 4 ) 為了誘導蛋白質的表達，加入終濃度為 1 mmol/L 的 IPTG，繼續在 37°C 培養 4 h。
( 5 ) 將細胞培養物轉移至 50 ml 的 Falcon 離心管中（每種細胞培養物轉移到兩個離心管中），1900 g 離心 10 min，收集細胞，并立即保存于 -80℃。
非變性蛋白質純化（以下步驟均在 0~4°C 下操作）：
( 1 ) 取出 -80°C 冰凍保存的沉淀物，在冰上解凍。
( 2 ) 用 0.5 ml 含 0.25 mg/ml 溶菌酶和 0.1 mmol/L PMSF 的裂解液裂解處理細胞。
( 3 ) 匯總裂解產物，用設置為一半功率的超聲勻漿器在冰浴條件下剪切處理裂解產物中的 DNA 3 次，每次 1 min。
( 4 ) 將裂解產物轉移至 1.5 ml 離心管中，20000 g，4°C 離心 30 min。
( 5 ) 將上清液轉移至新的離心管中。
( 6 ) 加入 250 μl 的 NiNTA-瓊脂糖，4°C 300 r/min 振搖 1 h，以結合組氨酸標記的蛋白質。
( 7 ) 將混合物轉移至 1 ml 的聚丙烯柱子中。
( 8 ) 用 10 倍體積的非變性洗滌液洗滌柱子。
( 9 ) 蛋白質分 4 步洗脫步驟洗脫，每次洗脫用 0.5 ml 非變性洗脫液。
( 10 ) 蛋白質與甘油 [ 終濃度為 20% ( V/V) ] 混合后保存于 -80℃ ( 見注釋 1)。我們建議在每一步的離心、裂解、洗滌和洗脫過程中，取小樣進行聚丙烯酰胺凝膠 ( 如 15% ) 電泳（圖 29-1)，檢驗這些純化步驟的效率。用 Bradford 檢測方法確定蛋白質濃度 [26] 。
3.2 蛋白質芯片上的激酶檢測建議在進行芯片實驗之前，先用一個已知的底物作正對照，檢測激酶的活性（見注 釋 2，3) 。同時還必須排除這個激酶對重組蛋白質對 3' 或 5' 端標記物磷酸化作用的可能性，如組氨酸標記 （ 見注釋 4) 。
在此，我們介紹一種激酶檢測后的信號分析方法。我們將樣品蛋白質和對照（見注釋 3 ) 用 10 X 10 的點樣模式 （ 見注釋 6) ，點樣在 FSAT 片基上（見注釋 5 ) ，每個樣品重復點樣 4 次。用于定量分析的點樣模式最近已被報道 [23] 。
激酶檢測：
( 1 ) 將在 4°C 密封保存的頭一天點樣的蛋白質芯片（構建方法參見第 28 章）室溫下用 TBST 劇烈振搖洗滌 1 h ( 見注釋 7 ) 。
( 2 ) 用 2% BSA/TBST 在室溫條件下對洗過的芯片進行封閉處理 1 h。
( 3 ) 將封閉處理過的芯片放置在用 TBST 浸泡過的 Whatman 濾紙上，這樣可以使芯片在接下來的激酶反應過程中不會干燥。
( 4 ) 室溫下，將芯片置于 250 μl 激酶溶液中孵育 1 h，激酶溶液包含 13 μg/ml 的 CK2α 和 25 μCi/ml 放射性標記的 [ y33-P] ATP ( 見注釋 1) 。孵育過程要加蓋進行。
( 5 ) 用 TBST 洗滌 6 次，每次 30 min。
( 6 ) 最終，芯片用微量滴定板離心機（如 Eppendorf， Hamburg，Germany，產品目錄號：5810 R ) 干燥，或者手動吹干，然后轉移至 X 射線盒。
( 7 ) 用 X 射線膠片進行信號檢測，將膠片放在芯片上，X 射線盒在 -80°C 保存適當的時間（見注釋 8) 。然后，膠片在暗室中沖洗顯影。另一種檢測方法是，將膠片曝光于成像板上，然后用磷屏顯像儀進行信號檢測（見注釋 8) 。
圖 29-2 ( 左）顯示了 CK2α 磷酸化篩選實驗中，芯片對 X 射線膠片曝光后的典型結果，幾個蛋白質的4 次重復點樣在膠片上給出了不同的信號。
為了確定組氨酸標記的重組蛋白質在芯片上的定位，我們用本書中介紹的（見第 28 章）一種抗 RGS-His6 的抗體篩選這些蛋白質。幾乎所有點樣蛋白質都可以被檢測到（約 95% ) ，如圖 29-2 ( 右）所示。
3.3 潛在激酶靶蛋白的選擇
在進行信號分析時，需要這個激酶不同方式的兩個獨立的實驗結果。
潛在激酶靶蛋白的選擇標準：
( 1 ) 在一個實驗中如果一個樣品的所有 4 個點樣點在 X 射線膠片或磷屏顯像儀上都給出一個相同的信號（圖 29-2)，那么這個蛋白質被認為是陽性的。
( 2 ) 如果在兩次實驗中都得到了陽性結果，這個蛋白質就被認為是一個可能的靶蛋白。
例如，從接近 800 個不同的大麥蛋白中鑒定出 21 個可能的 CK2α 靶蛋白「 22 」。最近報道了一種芯片磷酸化后用基于閾值的定量系統篩選潛在靶蛋白的方法。
3.4 潛在磷酸化靶蛋白的驗證
當使用這種基于芯片的磷酸化方法作為一種離體外鑒定潛在磷酸化靶蛋白質的篩選工具時，這些被鑒定的蛋白質要用其他方法進行驗證，包括離體與活體的方法，其中一些方法已在前言中提及。
我們用印跡磷酸化檢測來離體驗證潛在底物：
( 1 ) 用 SDS-PAGE 分離蛋白質，如用 15% SDS-PAGE，然后將蛋白質轉移到 PVDF 膜上。轉膜后，用考馬斯亮藍染色凝膠，檢驗蛋白質的轉移效率。
( 2 ) 用本書中介紹的基于芯片檢測的反應條件以及適當的體積，在印跡膜上進行磷酸化反應。
圖 29-3 顯示了印跡磷酸化實驗的一個經典的例子。我們對在兩個芯片實驗中用 MAP 激酶鑒定為潛在底物的 48 個蛋白質進行驗證，幾乎所有的蛋白質都得到了確認，如圖 29-3 所示。我們使用與芯片實驗相同的陽性對照：不同濃度的髓鞘堿性蛋白 ( MBP、MAP 激酶的人工底物）。陰性對照蛋白用那些在基于芯片的激酶檢測中檢測 到，但還未被鑒定為是潛在底物的蛋白質（圖 29-3)。
其他的體外驗證方法是在溶液中進行的磷酸化檢驗，應用 SDS 電泳和放射性自顯影檢測磷酸化蛋白質 [ 8，23] 。Fukunaga 和 Hunter 曾用這種方法來驗證用噬菌體 cDNA 表達文庫磷酸化篩選鑒定的激酶底物。