試劑、試劑盒 葉片懸浮緩沖液EDTA 水溶液硫脲緩沖液硫酸銨溶液SDS 溶液
儀器、耗材 細胞等電聚焦電泳儀等電聚焦托盤及蓋
實驗步驟
3.1 葉和根組織的收集和沉淀蛋白
( 1 ) 從植物的中部切取綠色葉片，迅速放入塑料袋里冷卻。如果沒有冰箱，可先放到冰上，再放入 -20°C 保存。
( 2 ) 對于根部組織，從莖部下面切一寸的根，搖晃根部并迅速放入水中洗掉泥土，連續洗 3 次，然后再迅速放入塑料袋里速凍或放在冰上暫時保存。
( 3 ) 稱取 2.5 g 速凍的根及葉組織，除去多余的莖及其他雜質，用預冷的剪刀將 這些組織剪成小碎片，放入預冷的研缽中，在液氮中磨碎。
( 4 ) 將這些研碎的根葉組織放入 40 ml 離心管中，用 25 ml 懸浮緩沖液懸浮這些粉末，用力搖晃混合，放 -20°C 保存 45 min，再搖，35000 g 離心 15 min。
( 5 ) 除去上清液，不攪動沉淀，用相同體積的 EDTA 水溶液洗沉淀（見注釋 1) ，放冰上 3~4 min。35000 g 離心 15 min，至少再洗兩次，直到沉淀不再是綠色。
( 6 ) 沉淀冷凍干燥，直到變成灰褐色。它含有蛋白以及細胞壁和纖維等其他物質。
3.2 從 TCA/丙酮粉末中制備蛋白樣本
( 1 ) 稱取 15 mg 的 TCA/丙酮粉末（15. 3.1 中制備好的沉淀），放入 1.5 ml 的離心管。
( 2 ) 向每一個離心管中加 1 ml 的 100 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.5 ) ，禍旋 1 min，18000 g 離心 10 min，去掉上清液（見注釋 2) 。
( 3 ) 向每個離心管中加 1 ml 的硫脲緩沖液，從粉末中萃取蛋白質，渦旋 5 min，超聲 10 min。然后在搖床中搖 30 min。
( 4 ) 18000 g 離心 10 min，取上清液。上清液中含有從葉組織中抽取的蛋白質， 濃度為 0.5~1 μg/μl。
3.3 制備 CyDyes 染料及蛋白熒光標記
( 1 ) 用新鮮的 DMF 制備 CyDyes ( 見注釋 3 ) ，因 DMF 容易氧化降解， 所以制備 CyDyes 染料時要用新鮮的 DMF。
( 2 ) 制備 CyDyes 溶液，每 1 μl CyDyes 染料中加入 1.5 μl DMF。1 ml CyDyes 溶液用來標記 50 μg 的蛋白質（見注釋 4) 。由于 CyDyes 對光敏感，故需用錫箔紙包住離心管，放在黑暗中保存。
( 3 ) 每個樣品吸 100 μl ( 含有 50 μg 的蛋白質）放入 0.6 ml 的離心管中（見注釋 5 )，這時候樣品還是分開的， 一 個樣品中放入 1 μl Cy3 工作液， 另外一個樣品中放入 1 μl Cy5 工作液（見注釋 6)。
( 4 ) 渦旋 10s，短暫離心，重復兩次。
( 5 ) 在冰上放置 30 min，避免光照。
( 6 ) 每個樣品中加入 1 μl 10 mmol/L 賴氨酸來終止反應，然后在冰上放置 10 min。
( 7 ) 每 100 μl 熒光標記的樣品加入 250 μl IPG 緩沖液，終體積為 450 μl ( 見注釋 7 ) 。
3.4 第一向蛋白質分離：等電聚焦
( 1 ) 將 Bio-Rad 聚焦托盤放入 Bio-Rad 的聚焦室內。吸取樣品放入中間的托盤內，避免氣泡產生。
( 2 ) 用鑷子去掉 IPG 干膠條的塑料皮，放入托盤里，確保陽極連著托盤的陽極 ，陰極對著陰極，仔細抬高膠條的一端，放下膠條的另外一端，確保整個膠條都能被緩沖液浸泡，還要確保沒有氣泡產生。
( 3 ) 用礦物油覆蓋膠條，防止通電時膠條變干。
( 4 ) 通常完全聚焦需要最少 67000 Vh。
a. 推薦程序：水化 50 V 12 h，500 V 1 h，1000 V 1 h，8000 V 9 h，100 V 5 h。
b. 第一步為水化，不能少于 12 h，由于 Cy 染料對光敏感，所以聚焦托盤應該覆蓋避免光照，或者整個儀器放在黑暗房間中使用。
c. 最后一步是移除窗口，膠條在這期間能夠取出。低電壓確保膠條能夠完全聚焦，直到從托盤中取出。
3.5 SDS-PAGE 二向凝膠的準備
( 1 ) 低熒光玻璃板減少背景的干擾。
a. 為了掃描時易于操作，玻璃板凝膠接觸的一面要涂抹親和硅烷。為了凝膠好剝離 下來，凝膠接觸的另一面要涂抹剝離硅烷。
b. 用 Milli-Q 超純水和紙巾擦拭低熒光玻璃板不接觸膠的那面，用乙醇和紙巾再擦拭一遍。
c. 每次加 0.5 ml 親和硅烷工作液到不接觸膠的那面，用紙巾使之均勻分散，直到每塊板總的工作液有 1 ml。
( 2 ) 先用乙醇擦拭玻璃板，接著用水擦，逐漸加入 0.5 ml 剝離硅烷直到每塊玻璃板都抹上了 1 ml 的剝離硅烷，干燥 5~10 min，除去多余液體。
( 3 ) 將玻璃板放在干凈的地方干燥至少 3 h，注意親和硅烷和剝離硅烷處理的玻璃板要分開放置。在灌膠前用氮氣吹走玻璃板上的灰塵。
( 4 ) 將紙質圓點標記放于用親和硅烷處理過的那面。每一個標記應當放在離板邊緣約 1.5 cm 的短邊的中點。根據編號系統，標記也應當放置在板邊緣約 1.5 cm 處的底部。這樣可以在隨后的每一個處理步驟中區分不同的凝膠。
( 5 ) 12.5% 凝膠的制備（總共 900 ml，可以灌 12 塊膠）：281 ml 40% 丙烯酰胺儲液，225 ml 1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8，376 ml Milli-Q H2O，9 ml 10% SDS，9 ml 10% 過硫酸銨，125 μl TEMED。先將丙烯酰胺、Tris-HCl、Milli-Q H2O 和 SDS 放入大燒杯中徹底混合，再過濾這種混合物（0.2 μmol/L ) ，然后放入一個貯存器中，貯存器通過一個蠕動泵和灌膠室連接。
( 6 ) 打幵攪拌器，迅速加入過硫酸銨和 TEMED ( 15s 內），打開蠕動泵。
a. 當幾乎所有的混合液被泵入時，打開混合器側面讓盡可能多的混合液泵入。
b. 在空氣進入管道前，加入置換液到軟管室。
c. 繼續緩慢灌膠，直到 12.5% 的溶液剛好低于不接觸膠板的頂部。