4. 轉基因遺傳分析
( 1 ) 低溫處理后，種子（每皿 10~12 粒）在 MS7 ( 25 ml/皿）培養基上萌發 1 周，用于分析轉基因的遺傳特性，如在 R。、R1、R2 代中 bar 基因的遺傳穩定性（見注 11)。
( 2 ) 或者在溫室中，利用多孔塑料盤（Griffin Green House and Nursery Supplies) 在土中（Metro Mix 360 Soil) 萌發種子并生長 2 周。用除草劑噴灑生長的植株（見注12)。
( 3 ) 1 周后，統計選擇培養基上萌發和未萌發的種子數，或溫室中除草劑處理后存活和死亡的植株數。
( 4 ) 采用 X2 檢驗（53 ) 分析轉基因在 R。、R1、R2 代的分離（表 10.2)。
5. 轉基因植株的分子檢測
(1) 聚合酶鏈反應（PCR)
① 轉基因植株中轉基因的檢測（如 bar 和 hav1) : 用葉片遵照 REDExtract- N-Amp Plant PCR試劑盒（Sigma- Aldrich， St. Louis, MO, Cat# XNA- P ) 的說明書操作提取 DNA。
② 使用正向（F ) 和 反向（R ) PCR 引物：例如，bar- F：5'-ATGAGCCCAGAACGACG-3'；bar- R：5'-TCA GATCTCGGTGACGG-3'；hva1-R：5' -TGGCCTCCAACCAGAACCAG-3'；hva1- R：5'-ACGACTAAAGGA ACGGAAAT-3’。
③ 在 PCR 儀（如 Per-kin Elmer/Applied Biosystem， Foster City, CA) 上進行 DNA 擴增。擴增反應起始用 94°C 變性 4 min，隨后 94°C 1 min、55°C 1 min、72℃ 2 min 進行 35 個循環，最后 72°C 延伸 10 min。
④ 在 0.8% (m/V) 的瓊脂糖凝膠分離并分析 PCR 產物，凝膠用 EB 染色后在紫外燈下觀察。轉基因條帶大小分別是： bar 為 0.59 kb，hva1 為 0.70 kb [ 圖 10.3 ( a ) ]。
(2) Southern 雜交分析
① 用基因編碼區（如 hva1 或 bar1 ) 序列作為探針進行 Southern 雜交 [54]。
② 用 Phytopure 植物 DNA 提取試劑盒（Amersham-Pharmacia Biotech) 提取轉基因和非轉基因植株的基因組DNA。
③ 用 10 μg R0、R1 和 R2 代植株的基因組 DNA 進行 Southern 雜交分析。
④ 用 HindIII 和 HindIII-BamH I 限制酶酶切消化基因組 DNA，然后在 0.8% 的瓊脂糖膠上電泳分離片段。
⑤ 將膠變性和中和并印跡到 Hybond-N+ 膜上（Amersham-Pharmacia Biotech) , 依照 Sambrook 等描述的方法[55]。
⑥ 用 HindIII-BamH I 酶切 pBY520 質粒，在 0.8% 的低熔點膠上分離帶有 hva1 編碼區的片段。切下 1.0 kb 的片段，用 QIAquick PCR 純化試劑盒純化該片段。
⑦ 用 Rad 引物標記試劑盒（GIBC0 BRL) 對純化的基因特異的 DNA 片段進行 [ 32P] -dCTP 放射性標記，方法參照說明書。
⑧ 按照標準程序[ 55 ] 用 hav1 基因特異探針與準備好的膜進行雜交。
⑨ 隨后，-80°C 條件下用 X 光膠片（Kodak ) 放射自顯影分析雜交膜 [ 圖10.3 ( b )]。
(3) Northern 雜交分析
① 用 TRIZOL (GIBCO BRL) 提取轉基因和非轉基因植株幼葉的總 RNA，方法參照說明書。
② 依照 Sambrook 等的方法在 1.2% 的瓊脂糖-甲醛變性膠中電泳分離 10 μg 總 RNA [55]。
③ 依照 Sambrook 等的方法將股印跡到 Hybond-N+ 尼龍膜（Amersham-Pharmacia Biotech) 上 [55]。
④ 按照標準的 Northern 雜交程序 [55]，用 32P 標記的基因特異的探針分析 hva1 的轉錄情況 [ 圖 10.3 ( c ) ]。
(4) Western 雜交分析
① 蛋白質提取、Western 雜交和免疫檢測參照 Xu 等的方法[48]。
② 在液氮中研磨約 0.1 g 轉基因和非轉基因植株的新鮮葉片，加入 0.2 ml 蛋白提取緩沖液提取蛋白質。
③ 用 Bio-Rad 蛋白分析試劑（ Bio-Rad) 按 Bradford 的方法測定每一樣品的總蛋白濃度 [56]。
④ 用 12% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 100 μg 轉基因和非轉基因樣品的可溶性總蛋白。
⑤ 電泳結束后，使用半干轉移系統（ Bio- Rad ) 將蛋白質電轉到硝酸-纖維素膜上(Amersham-Pharmacia Biotech) ，方法參照儀器說明。
⑥ 將 Western 膜分別和轉基因特異蛋白（如 HVA1 ) 免疫產生的一抗（ 如兔抗血清）及二抗（帶有堿性磷酸酶的兔 IgG 的抗體，Sigma- Aldrich) 孵育。
⑦ 在堿性磷酸酶的緩沖液中進行膜顯色 [ 圖10.3 ( d ) ]。