近幾年CAR-T因其在白血病等液體瘤上的巨大潛力，被認為是最有前景的腫瘤治療方式之一，然而依然存在如免疫抑制微環境、T細胞效力不強及細胞毒性等難題制約著CAR-T功效的發揮。前兩期我們已經學習了CAR-T的基本知識，本期，我們就為大家介紹，CAR-T療法中影響T細胞功能（增殖能力和免疫功能）的一些小明星分子，如細胞因子IL-7、IL18、IL-21，IL15等在腫瘤免疫方面的功效。也許它們可以為CAR-T的效力提升打開新的一扇窗。
什么是細胞因子？
細胞因子（cytokine，CK）是一種主要由活化的免疫細胞分泌的、介導和調節細胞功能（免疫反應、炎癥反應、造血功能等）的小分子可溶性蛋白質。根據功能不同，可被分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等幾大類。
細胞因子與腫瘤的關系
近年有實驗結果表明：給腫瘤局部注射細胞因子IL-2，大量粒細胞和巨噬細胞被招募至腫瘤區域甚至是滲透到腫瘤內部，致使發生強大的抗腫瘤作用，最終腫瘤退化。除此之外，一些其他的細胞因子如IFN-α、GMCSF等也可以誘導腫瘤細胞死亡，這提示CK在抗腫瘤領域具有的廣闊的應用前景。
細胞因子與CAR-T的關系是什么呢？
目前腫瘤免疫療法CAR-T發展如火如荼，但是依然存在阻礙，如T細胞壽命短，效力不夠等，這些問題嚴重阻礙了CAR-T治愈腫瘤的功效，特別是在實體瘤根治上。鑒于細胞因子的抗腫瘤功能，不難想到，也許共表達這些細胞因子會解決這一難題，并有望成為攻克實體腫瘤的重要手段。
如第四代CAR-T：在第二/第三代CAR-T的基礎上共表達一些關鍵的細胞因子中就表現出了克服實體瘤免疫抑制微環境的能力。
以IL-12為例，系統注射IL-12會引起嚴重的炎癥副反應，但是通過共表達IL-12的第四代CAR-T細胞來實現局部表達后，可以在腫瘤病灶處招募NK細胞，或者直接逆轉被耗竭的腫瘤浸潤性T淋巴細胞，從而有效克服腫瘤免疫抑制微環境。還有一些研究發現，在CAR-T細胞中共表達某些趨化因子，也可以增強CAR-T細胞的歸巢能力。
因此，嘗試著將具備重要免疫調節能力的細胞因子在CAR-T細胞中共表達，如IL-7、IL18、IL-21，IL15等細胞因子，很可能對T細胞的活性有很大的提升。
本期就先為大家介紹一下細胞因子IL-7的功能及與腫瘤免疫的關系。
人白細胞介素7（interleukin-7，IL7）是一種多效細胞因子，具有廣泛的免疫效應。長期以來，對于IL-7的認識一直處于影響B細胞和T細胞的生長、存活及分化[1]。但在近年來，某些研究表明IL-7在抗腫瘤方面有直接或間接的作用。下面就一起來看看IL-7的發現、功能及應用。
IL-7的發現 1987年Hunt等人在實驗中發現，1988年Namen等將其純化、克隆出來，命名為淋巴細胞生成素-1，同年被命為白細胞介素7。IL-7/IL-7R介導的經典的信號通路如下圖一所示[4]：
IL-7與T細胞有什么關系呢？
1. 調控T細胞的發育
Ｔ細胞在胸腺發育過程中，受IL-7Rα表達的調控。在TCR介導下也可重新誘導IL-7Rα表達。如圖為：IL7/7R調控T細胞的發育。TCR信號持續，IL-7R信號受阻，分化為CD4+單陽性T細胞；TCR信號的終止，IL-7R信號傳導，分化為CD8+單陽性T細胞[5]。
2.促進T細胞的增殖
研究發現，IL-7的表達與T細胞增殖密切相關。如用IL-7刺激新鮮T細胞，T細胞可劑量依賴性擴增，包括CD4+和CD8+亞群；敲除IL-7R，T細胞會停止生長；轉入IL-7基因可促進CD4+/ CD8+T細胞的增殖。但CD4+和CD8+T細胞對IL-7對有不同的應答效果。IL-7對CD8+T細胞亞群的作用要強于CD4+細胞亞群[6, 7]。
如下圖，Lisa A等人在探究IL-7激活T細胞是否與誘導增殖有關實驗中，通過給小鼠體內注射IL-7，能夠誘導活化狀態下T細胞增殖，并且給藥時間越久，增殖倍數越大；并且IL-7注射時間大于4天后，CD8+T細胞亞群的增殖倍數要強于CD4+細胞亞群。
3.延長記憶性T細胞的存活時間
IL -7Rα會選擇性地表達于初次免疫應答中的小部分效應T細胞，而后轉化為中樞性記憶性T細胞。并且IL-7對于記憶T細胞的存活尤為重要。而在淋巴細胞減少癥中，IL-15對于記憶性T細胞的作用可以被IL-7取代[8]。
4.抗腫瘤作用
早在1994年，McBride等人將重組人IL-7注射人纖維肉瘤小鼠的腫瘤基底部，發現IL-7能抑制腫瘤生長，甚至使部分小鼠腫塊完全消退[9]！！！這是因為重組人IL-7腹腔用藥能使正常或荷瘤小鼠脾、淋巴結中白細胞增多，表明外源性注射IL-7體可以誘導了機體抗腫瘤免疫機制。
David H. Lynch等人通過向特異性抗腫瘤的CTL細胞（細胞毒性T淋巴細胞，一種特異T細胞，專門分泌各種細胞因子參與免疫作用；對某些病毒、腫瘤細胞等抗原物質具有殺傷作用），培養基中添加IL-2/4/7，探討這3種細胞因子對CTL細胞抗腫瘤能力的影響。結果顯示IL7是最有效的；單獨或與低劑量的IL2組合，CTL的擴增能力增強6-8倍；而只添加IL7時，抗腫瘤能力較對照組強4倍；單獨添加IL4或與IL2組合，抗腫瘤能力較對照組低于4倍[10]。
IL-7目前有哪些臨床應用呢？
介于IL-7強大的免疫效應，尤其是調節Ｔ細胞的增殖、維持其細胞內環境穩定，并能增強T免疫應答的能力等的功能，使得IL-7作為一種免疫調節因子越來越受到關注。
目前將IL-7應用于免疫治療已進入臨床并取得一定的療效，其中包括黑色素瘤和淋巴瘤、宮頸癌、結腸癌等等。
如M?ller等人通過將IL-7修飾自體腫瘤疫苗，經皮下注射給惡性黑色素瘤患者，發現所有患者均耐受瘤苗，副作用少。免疫監測其中8例患者，發現殺傷T細胞數量顯著增多。只有其中2例在接種后1天出現低熱和輕度流感樣癥狀。
截止目前的臨床數據一致證明：IL7具強大的擴增初始T細胞和抗腫瘤能力。并且其副作用少，患者可耐受。這為IL-7用于腫瘤治療提供了契機。
綜上，對IL-7用于腫瘤治療應用前景予以期待
①制備第四代CAR-T細胞。傳統的二代、三代CAR-T細胞在體內的存活時間較短，擴增能力較弱。共表達IL-7可以延長CAR-T細胞的存活時間并提高擴增能力和殺傷腫瘤的能力；
②制備更強大的免疫性能的瘤苗。將IL-7與其他生長因子(如B7)共同轉染瘤細胞，可提高瘤細胞的免疫原性，從而誘發機體產生更強的抗腫瘤作用；上一期，我們對CAR-T療法已經有了一些初步的認識。因其在腫瘤免疫治療中的巨大潛力，成為了備受世人矚目的一顆新星。所有的成功并非一蹴而就，CAR-T亦是如此，那么它是如何一步步從不知名的小人物蛻變成家喻戶曉的大明星呢，今天就帶大家看看CAR-T這幾代的成長之路。
與其他許多新興的腫瘤治療方式一樣，CAR-T的問世并非一帆風順，公眾質疑聲一直存在，如實效性、持續性、安全性、通用性等問題，加重了人們對CAR-T療法發展和轉化應用的顧慮。然而令人欣慰的是，經過幾十年來的發展和改進，CAR-T療法也經歷了一條不斷完善、成熟、優化、提高的發展之路。
從技術和功能特點的角度，CAR-T至今已經發展出了五個技術代系
那CAR-T是如何發展到第五代，各自的技術特點以及臨床前或臨床應用怎樣呢，本期欄目就給大家來細細道來。
I代CAR-T雛形：ScFv -鉸鏈區 -跨膜區 -CD3z融合表達的結構
出現時間：1989年，美國科學院院刊(PNAS)報道了第一代CAR-T療法
結構：通過基因修飾使T細胞表達特異性腫瘤細胞表面抗原的分子單鏈抗體，結合一胞外鉸鏈區和跨膜區以及胞內的T細胞激活受體CD3z鏈，靶向B細胞惡性腫瘤的CD19和CD20蛋白分子。
特點：效用低，易耗竭
臨床應用：第一代CAR很快就被投入臨床試驗，但是雖能看到一些特異性的細胞毒性，但2006年對其進行臨床試驗總結的時卻發現療效差強人意。究其原因在于第一代CAR-T細胞在病人體內很快就會耗竭，其持久性（persistence）很差，以至于CAR-T細胞還沒有來得及接觸到大量的腫瘤細胞時就已凋亡。
II代：加入T細胞活化和生存必需的共刺激信號分子
出現時間：1998年，面對第一代CAR-T的缺陷，第二代CAR-T 技術應運而生
改進結構：將T細胞活化和生存必需的共刺激信號分子CD137（或CD28、ICOS、OX-40）組裝進CAR，提升CAR-T細胞在體內的擴增能力和存活能力。
特點：效果顯著，發展成熟
臨床應用：率先在小鼠B淋巴細胞性白血病模型中取得成功，并在隨后的臨床試驗中其表現也超出了預期效果，對于復發或難治性急性B淋巴細胞白血病（r/r-ALL）患者的緩解率高達90%以上。基于其顯著的腫瘤殺傷效果，目前開展的臨床試驗多是第二代CAR-T。
最值得一提就是獲FDA專家一致推薦批準上市的諾華主打的 CAR-T 藥物 CTL019，就屬于二代 CAR-T 的范疇，胞內信號區共刺激信號為CD137（即4-1BB）。
此外，Juno Therapeutics 研發的JCAR014，JCAR015，JCAR017 產品， Kite Pharma研發的KTE-C19以及Bluebird/Celgene研發的CART19等產品均屬于第二代CAR-T。
III代CAR-T：兩條腿走路，反倒崴了腳
既然整合了共刺激信號后能夠顯著提高CAR-T的治療效果，而T細胞擁有數量眾多的共刺激信號分子，那么將這些共刺激信號分子共同整合進CAR分子結構中，治療效果不就相對于二代CAR-T更為理想了嗎？這一想法從多方面來看似乎就是個非常不錯的idea由此第三代CAR也就隨即問世了。
改進結構：通用的做法是在第二代CAR的基礎上再增加一個共刺激信號分子，比如將CD28-CD137（4-1BB）分子同時組裝進CAR里面。早前報道的Uppsala University 研發的靶向CD19分子的CART19 (NCT02132624)即屬于第三代CAR，胞內信號區共刺激信號也為CD28-CD137。
特點：然而，存在很大缺陷，細胞迅速耗竭，復發率較高
有研究表明，CD28與4-1BB相比存在重大缺陷：CD28的特點是刺激CAR-T細胞在體內迅速擴增（細胞因子風暴風險大大提高），但同時也使得細胞迅速耗竭，復發率較高。總體來說，共同整合有CD28分子的三代CAR-T療效并不比二代CAR-T優良，甚至在有些時候會造成災難性的后果（這就尷尬了，囧~~）。
臨床應用： JUNO以CD28為共刺激結構域的CAR-T產品（CD28zCAR）JCAR015在臨床試驗中很不順利，先后發生5起死亡事件。2017年3月，Juno宣布放棄JCAR015，轉而重點發展同樣為CD19靶點、以4-1BB為共刺激結構域的CAR-T產品（4-1BBzCAR）JCAR017及JCAR014。
JUNO的教訓令各大CAR-T研發機構驚魂未定，心有余悸，使得三代CAR-T在人們的失望中悄然謝幕，即使仍有部分研究，但CAR-T的主力軍大旗已經毫無懸念地轉到了二代CAR-T之手。三代CAR-T就這樣剎羽而歸，不過即便如此也并不能澆滅人們對于CAR-T療法的信心，CAR-T技術的研發和改進仍然在路上。
IV代CAR-T：調節基因，性能升級
改進結構：在第二/第三代CAR-T 的基礎上共表達一些關鍵的細胞因子或共刺激配體，可以顯著提升T細胞擴增活性和壽命。該類CAR-T技術也被稱為“TRUCK”。
特點：最新進展中，第四代CAR-T表現出了克服實體瘤免疫抑制微環境的能力，有望成為實體腫瘤治療中的重要手段。
以IL-12為例，這一細胞因子被譽為T淋巴細胞的第三信號分子，可見其對T細胞功能的重要性。系統注射IL-12會引起嚴重的炎癥副反應，但是通過共表達IL-12的第四代CAR-T細胞來實現局部表達后，可以在腫瘤病灶處招募NK細胞，或者直接逆轉被耗竭的腫瘤浸潤性T淋巴細胞，從而有效克服腫瘤免疫抑制微環境。還有一些研究發現，在CAR-T細胞中共表達某些趨化因子，也可以增強CAR-T細胞的歸巢能力。
此外，其它具備重要免疫調節能力的細胞因子也正在被人們嘗試著在CAR-T細胞中共表達，如IL-7、IL18、IL-21，IL15等，我們將在后續欄目中跟大家詳細介紹這幾個重要細胞因子及其與CAR-T研究的進展，敬請關注~
當然，細胞因子風暴本來就是CAR-T治療過程中的關鍵副作用之一，整合細胞因子共表達似乎是在“火上澆油”，而研究人員也注意到了這一點，在另外一些臨床研究中，科學家們正在嘗試設置“分子開關或基因開關”機制，試圖控制CAR-T在體內的功效，必要時中止細胞因子釋放，避免對機體的傷害。
整合細胞因子表達實現了CAR-T細胞在腫瘤殺傷功能與微環境調節方面的升級換代，其臨床效果、適用性、安全性、穩定性如何，相信未來會有不少臨床前和臨床數據來回應業內關切，我們拭目以待！
V
代CAR-T：通用型，閃亮新星
改進思路：盡管CAR-T細胞療法擁有多種優勢，但其高度個性化的特質使其不便于cGMP生產管理和進行大規模即時應用，且治療成本高昂，因此，開發通用型的CAR-T細胞療法以彌補上述不足，正逐漸成為CAR-T細胞治療領域的必然趨勢之一。
改進結構：通用型的CAR-T本質上是一種同種異體CAR-T細胞療法，利用基因編輯技術，不需要依據患者進行相應修飾，而是直接將來源于非患者(non-patient) 供體的T細胞進行工程化，用于多個患者的治療。簡單來說，就是從健康捐獻者身上獲得T細胞后將T細胞的HLA基因及TCR基因敲除，避免宿主對輸注CAR-T細胞的免疫排斥（或移植物抗宿主病），從而生產出通用的T細胞產品，此類產品理論上可用于多個患者的臨床治療。
臨床應用： 近期，通用型CAR-T細胞療法也給我們帶來了一個又一個驚喜。2月7日，Cellectis公司宣布其通用型CAR-T療法UCART123獲得了美國FDA的IND（Investigational New Drug)批準，成為第一款獲美國FDA批準進入臨床試驗的此類產品。3月10日，施維雅（Servier）、輝瑞（Pfizer）和Cellectis公司聯合宣布，美國FDA批準了通用型CAR-T療法UCART19 IND資格，可在美國進入臨床發展，用于治療復發/難治性急性淋巴細胞白血病適應癥。
對第五代通用型CAR-T療法在臨床上的治療效果，我們也在持續關注和期待中！ 同時，我們也希望在世界各國研究人員的共同努力下，CAR-T細胞療法未來能取得更好更快的發展，讓越來越優質的CAR-T療法盡快問世，造福廣大患者！
③IL-7與其他細胞因子聯合使用。IL-2是目前公認具有較強抗腫瘤作用的細胞因子之一，但是臨床應用來的毒副作用較大，IL-7副作用少，因此可減少IL-2用量，以減輕毒副作用。
綜上所述，IL-7在腫瘤免疫方面發揮著巨大功效，如調節Ｔ細胞的增殖、維持其細胞內環境穩定，并能增強T免疫應答的能力等，相信若是IL-7恰當地參與到腫瘤免疫中，如共表達到CAR-T，也許會給CAR-T帶來不一樣的抗腫瘤的功效，讓我們拭目以待。
