三．凝膠孔徑的調節
凝膠孔徑、機械性能(彈性)、透明度等在很大程度上取決于Acr和Bis二者的總濃度T%。T%越大，孔徑越小，機械強度則增加。凝膠的特性是分子篩效應。在聚合前調節單體的濃度來控制凝膠孔徑大小，有利于針對樣品分子大小，增加分辨力。為此可以根據分離樣品分子大小配制不同孔徑的凝膠。一般大孔膠易碎，小孔膠難以取出。另外考慮選擇適宜的緩沖液。緩沖液的作用一是用來維持容器內和凝膠外的pH恒定，二是作為在電場中傳導電流的電解質。要使緩沖液很好地完成這些作用，必須注意三個條件：第一，緩沖液不與被分離的物質相互作用；第二，緩沖液pH值不能使蛋白質變性，對于分離蛋白質的最大pH限度通常是
pH4.5～9.0；最后還要考慮到緩沖液的離子強度。
四．分離蛋白的基本原理
聚丙烯酰胺凝膠電泳根據其有無濃縮效應，分為連續系統與不連續系統兩大類，前者電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應；后者電泳體系中由于緩沖液離子成分、帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及電位梯度的不連續性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應、分子篩效應，還具有濃縮效應，因此具有很高的分辯率。
不連續體系由電極緩沖液、樣品膠、濃縮膠及分離膠所組成，它們在直立的玻璃管（或2層玻璃板中）排列順序依次為上層樣品膠、中間濃縮膠、下層分離膠。樣品膠是核黃素催化聚合而成的大孔膠，其作用是防止對流，促使樣品濃縮以免被電極緩沖液稀釋。目前，一般不用樣品膠，直接在樣品液中加入等體積40%
的蔗糖，同樣具有防止對流及樣品被稀釋的作用。實際上，濃縮膠膠的延續，凝膠濃度及值與樣品膠完全相同，其作用是使樣品進入分離膠前，被濃縮成窄的扁盤，從而提高分離效果。分離膠是由過硫酸銨催化聚合而成的小孔膠，主要起分子篩作用。在此電泳體系中，有2種孔徑的凝膠、2種緩沖液體系、3種pH值，因而形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續性，這是樣品濃縮的主要因素。PAGE具有較高的分辨率，就是因為在電泳體系中集樣品濃縮效應、分子篩效應及電荷效應為一體。下面就這3種物理效應的原理，分別加以說明。
1．樣品的濃縮效應
不連續電泳一般含有3種性質不完全一樣的凝膠，其組成如下：
（1）凝膠孔徑不連續性
在上述3層凝膠中，樣品膠及濃縮膠為大孔膠，分離膠為小孔膠。在電場作用下，蛋白質顆粒在大孔膠中泳動遇到的阻力小，移動速度快；當進入小孔膠時，蛋白質顆粒泳動受到的阻力大，移動速度減慢。因而在兩層凝膠交界處，由于凝膠孔徑的不連續性使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區帶。
（2）緩沖體系離子成分及pH值的不連續性
該系統的電極緩沖液是pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，樣品膠和濃縮膠是用pH6.7的Tris-HCl緩沖液制成的，電泳時，HCl在任何pH溶液中均易解離出Mg2+,它在電場中遷移率快，走在最前面稱為前導離子或快離子。在電極緩沖液中，除有Tris外，還有甘氨酸，它在
pH8.3的電極緩沖液中，易解離出NH2CH2COO-，而在pH6.7的凝膠緩沖體系中解離度最小，在電場中的遷移率很慢，稱為尾隨離子或慢離子。血清中，大多數蛋白質pI在5.0左右，在pH6.7或8.3時均帶負電荷，在電場中，都向正極移動，其有效遷移率介于快離子和慢離子之間，于是蛋白質就在快、慢離子形成的界面處，被濃縮為極窄的區帶。當進入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質，因此，Mg2+及NH2CH2COO-沿著離子界面繼續前進。蛋白質分子由于分子量大，被留在后面，然后再分成多個區帶。電泳開始時，在電流的作用下，濃縮膠中的氯離子（快離子）有效泳動率超過蛋白質的有效泳動率，很快泳動到最前面，蛋白質緊隨于其后，而G1y-成為慢離子，在最后面。快離子向前移動，而在快離子原來停留的那部分區域則形成了低離子濃度區，即低導區，電勢梯度增大。因此，低導電壓區就有較高的電勢梯度，這種高電勢又迫使蛋白質離子與慢離子在此區域加速前進，追趕快離子。夾在快、慢離子間的蛋白質樣品就在這個追趕過程中被逐漸地壓縮聚集成一條狹窄的起始區帶。
2．分子篩效應：
分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現出不同的遷移率，此即分子篩效應。顆位小，形狀為園球形的樣品分子，通過凝膠孔洞時受到的阻力小，移動較快；反之，顆粒大，形狀不規則的樣品分子，通過凝膠的阻力較大，移動慢。
3．電荷效應
當樣品進入分離膠后，由于每種蛋白質所帶的電荷多少不同，因而遷移率也不同。電荷多的，分子小的泳動速度快，反之，則慢。于是，各種蛋白質在凝膠中得以分離，并以一定的順序排列成一個一個圓盤狀。
等電聚焦電泳
等電聚焦電泳是利用具有pH梯度的電泳介質來分離等電點(pI)不同的蛋白質的電泳技術。這是六十年代后期才發展起來的新技術，基本原理是在制備聚丙烯胺膠凝膠時，在膠的混合液中加入載體兩性電解質(商品名Ampholine)。這種載體兩性電解質是一系列含有不同比例氨基及羧基的氨羧酸混合物，其分子量在300～1000范圍內，它們在pH2.5～11.0之間具有依次遞變但相距很近的等電點，并且在水溶液中能夠充分溶解。含有載體兩性電解質的凝膠，當通以直流電時，載體兩性電解質即形成一個從正極到負極連續增加的pH梯度。如果把蛋白質加人此體系中進行電泳時，不同的蛋白質即移動并聚焦于相當其等電點的位置。好的載體兩性電解質應具有以下特點：在等電點處有足夠的緩沖能力，不易被樣品等改變其pH梯度；必須有均勻的足夠高的電導，以便使一定的電流通過；分子量不宜太大，便于快速形成梯度并從被分離的高分子物質中除去；不與被分離物質發生化學反應或使之變性等。Ampholine是一種常用的載體兩性電解質。要取得滿意的等電聚焦電泳分離結果，除有好的載體兩性電解質外，還應有抗對流的措施，使已分離的蛋白質區帶不致發生再混合。要消除這種現象，辦法之一加入抗對流介質，用得最多的抗對流支持介質是聚丙烯酰胺凝膠。
等電聚焦電泳與其它區帶電泳比較具有更高的分辨率，等電點僅差0.01pH的物質即可分開；具有更好的濃縮效應，很稀的樣品也可進行分離，并且可直接測出蛋白質的等電點。所以此技術在高分子物質的分離、提純和鑒定中的應用日益廣泛。但是等電聚焦電泳技術要求有穩定的pH梯度和使用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質易發生沉淀。